Este método pode fornecer uma visão da variação genética na extinção não fotoquímica disponível em painéis de diversidade genética ou populações de reprodução. A principal vantagem desta técnica é o potencial de tela de um grande número de genótipos para variação na extinção não fotoquímica dentro de um único dia. O protocolo é apresentado para glicina max ou soja, mas pode ser adaptado para analisar outros espaços vegetais dos quais os discos de elevação podem ser coletados.
Para alguém que executa o protocolo pela primeira vez, a chave é manusear o disco de elevação para evitar danos ou esponjas saturadas com água. Para começar, prove as plantas no local do campo 30 dias após a germinação. Encha 1/3 nível de água destilada em todos os poços de uma placa de 24 poços.
Rotule a tampa e o lado da placa com as réplicas a serem amostradas. Segure a folha mais jovem totalmente expandida presente no topo da planta contra uma rolha de borracha. Pressione um borer de cortiça Humboldt número dois através da folha e torça para cortar um disco, evitando a costela média.
Colete consecutivamente cinco discos da mesma folha para réplicas técnicas. Empurre os discos de folha para fora do borer de cortiça em um único poço de uma placa de 24 poços usando um cotonete e repita isso para uma planta diferente do mesmo genótipo. Verifique se todos os discos de folha estão flutuando na água.
Se não, mova suavemente os discos de folha grudados na lateral de um poço em uma posição flutuante com um cotonete. Passe para a amostragem de discos da seguinte parcela. Coloque a tampa e o selo com uma filme flexível semi-transparente.
depois de completar a amostragem em toda a placa de 24 poços. Guarde a placa da luz solar direta em um saco, caixa ou refrigerador vazio. Em um espaço de laboratório limpo, toque na tampa da placa selada para desalojar discos de folhas presos à tampa durante o transporte.
Desembrulhe o filme e remova a tampa. Transfira um disco de folha da primeira posição da placa de 24 poços em uma placa fresca de 96 poços com o disco de folha virado para baixo na parte inferior do poço. Corte um filtro aspirador nasal ao meio.
Mergulhe o filtro resultante no meio da água e naufraga sobre uma toalha de papel para remover o excesso de líquido. Insira o filtro no poço com o disco da folha para manter a umidade. Pegue um segundo disco de folha da primeira posição da placa de 24 poços e coloque-o de frente para baixo na próxima posição disponível da placa de 96 poços.
Mergulhe a metade restante do filtro nasal produzido em água e dab-lo em uma toalha de papel antes de inseri-lo no poço com o segundo disco de folha. Grave o canto superior direito para ajudar a orientar a placa no escuro para imagens. Veda matrículas com uma lu da fita flexível semi-transparente e enrole a placa em papel alumínio.
Escreva as IDs do lote e o ID da placa na folha de alumínio. Coloque as placas em uma caixa escura ou armário por um mínimo de 30 minutos para o relaxamento das duas primeiras fases de saciedade não fotoquímica. Use um período de incubação escura prolongado de uma hora antes da imagem se as fases de longo prazo de sacienchamento não fotoquímico forem de interesse.
Prepare uma placa manequim adicional para focalizar durante a análise, colocando um disco de folha em cada canto de uma placa fresca de 96 poços e uma no centro. Fixar discos de folhas com filtros nasais como feito com placas anteriores, selar a placa e incubar no escuro à temperatura ambiente e 50% de umidade relativa. Ligue o imager e abra o software de imagem.
Clique em Configurações seguidas de Protocolo para abrir uma janela para a entrada de etapas no protocolo experimental PAM. Defina as especificações técnicas da máquina fornecidas no manuscrito. Defina o programa para começar com um pulso saturado para medir a eficiência quântica máxima da fotossíntese adaptada ao escuro, inserindo 20 segundos na caixa nomeada após um atraso de.
Clique na caixa Aplique pulso e digite 1 na caixa intitulada Este número de vezes. Defina o pulso PPFD para 6.152, o comprimento do pulso para 800 milissegundos, e verifique a caixa Leve as imagens prime e FM prime com todos os pulsos. Verifique Inserir depois para adicionar um segundo passo ao protocolo.
Digite 30 segundos na caixa intitulada Após um atraso de. Em seguida, selecione a opção Alterar actinic e digite 50 na caixa intitulada Actinic PPFD para definir a intensidade da luz na câmara para 50 PPFD. Clique em Inserir depois para adicionar uma nova etapa ao protocolo e digite 150 segundos na caixa intitulada Após um atraso de.
Selecione Aplicar pulso e digitar 4 na caixa intitulada Este número de vezes para aplicar pulsos de medição a cada 150 segundos quatro vezes seguidas enquanto a luz actínica é mantida a 50 PPFD. Ajuste o atraso e a intensidade da luz para cada etapa de acordo com os valores fornecidos no manuscrito antes de salvar o protocolo como um arquivo pcl no local desejado. Desligue a luz e coloque a placa falsa de frente para baixo no estágio da amostra para que a superfície adaxial da folha aponte para cima em direção ao detector e que a esponja esteja virada para baixo em direção à plataforma.
Ajuste a altura do estágio da amostra para que os discos da folha estejam 140 milímetros acima da base do instrumento. Clique na câmera de conexão/desconexão com a câmera de imagem e o ícone da câmera de hardware para iniciar a câmera. Clique no símbolo de fluorescência de foco, representado por um ícone de seta de cor vermelha, de dois lados, com duas linhas verdes na base, e ajuste a lente e a exposição para colocar a placa em foco.
Clique novamente no ícone de fluorescência de foco para desligar a luz piscando. Trabalhando no escuro, substitua a placa falsa pela placa a ser analisada. Coloque-o de frente para baixo com a fita do lado de fora usada para orientar o canto superior direito e clique no ícone da câmera de imagem do mapa.
Ajuste a exposição da imagem abrindo ou fechando a abertura até que a barra na janela pop-up esteja posicionada na zona verde. Clique no botão Tentar novamente após cada ajuste da abertura até que a exposição seja corretamente ajustada e o instrumento tire uma imagem. Clique com o botão direito do mouse na imagem e selecione Aplicar isolamento de imagem para bloquear sinais de fundo.
A área da folha focada será exibida em cinza e o fundo em azul. Selecione a área ou pixels de interesse para incluir apenas os discos de folha ajustando o histograma e o nível gama do menu Desagraxo puxar para baixo pelo botão direito clicando na imagem. Clique com o botão direito do mouse na imagem e selecione Excluir cortes altos e baixos para excluir as áreas destacadas do azul claro.
Clique com o botão direito do mouse na imagem e selecione Excluir desgarrados para remover quaisquer pixels que não toquem nos últimos três pixels. Todas as áreas da imagem que aparecerem como ilhas isoladas serão analisadas separadamente e incluídas na saída final de dados. Clique no ícone do protocolo de execução para iniciar o programa.
Um temporizador aparecerá na parte inferior da tela informando quanto tempo o protocolo ainda tem para ser executado. Espere até o protocolo terminar. Clique em Arquivo e Salvar para salvar os dados como um arquivo igr.
Feche a janela clicando na cruz vermelha no canto superior direito da janela antes de iniciar outra placa de amostra. Para exportar os dados de fluorescência de clorofila, abra o arquivo igr no software de imagem e clique em Arquivo seguido de Exportação para Pasta para criar uma nova pasta com todos os arquivos necessários. Uma medida típica de saciedoção não fotoquímica em soja cultivada em campo mostrou que após um flash saturante inicial para determinar a Fv/Fm quando os discos de folha foram expostos à baixa luz de 50 micromoles por metro por segundo, a saciedação não fotoquímica foi menor que uma.
Além disso, após a transferência para a luz alta de 2.000 micromoles por metro por segundo, a saciedação não fotoquímica aumentou até o valor máximo de quatro após 15 minutos. Uma medição falha mostrou um aumento mínimo na extinção não fotoquímica após a transferência para a luz alta. A orientação de placas dentro do imager e um plano claramente definido para amostragem e emplacamento de discos de folhas é essencial para garantir que os dados estão ligados ao genótipo correto.
Este protocolo pode quantificar o impacto de variáveis ambientais, como a seca e o derramamento em saciamento não fotoquímico ou avaliar a extinção não fotoquímica em diferentes níveis de dossel para refinar modelos de culturas.
