Nosso laboratório investiga alterações metabólicas na retina e em todo o sistema nervoso central que ocorrem com a idade, bem como em doenças neurodegenerativas. Nosso objetivo primordial é alavancar essas descobertas para identificar novos alvos terapêuticos para tratar doenças neurodegenerativas relacionadas à idade. A detecção da captação de glicose no tecido retiniano costuma ser cara e demorada, exigindo modalidades de imagem complicadas ou mesmo substâncias radioativas.
Estabelecemos este protocolo para fornecer uma nova técnica ex vivo para medir a captação de análogos de glicose fluorescente em amostras de retina. O protocolo que desenvolvemos fornece uma estratégia direta e econômica para medir a captação ex vivo de análogos fluorescentes de glicose em toda a retina intacta. Este método também é vantajoso, pois permite que os pesquisadores meçam várias amostras simultaneamente.
Este protocolo permitirá que os pesquisadores avaliem as mudanças na captação retiniana de análogos fluorescentes da glicose, o que nos ajudará a entender melhor como a retina utiliza a glicose como substrato energético tanto com a idade quanto em estados saudáveis e de doença. Para começar, prepare uma solução estoque de cinco milimolares 6-NBDG em uma mistura de 50% de DMSO e PBS. Armazenar alíquotas de 500 microlitros da solução a menos 20 graus Celsius.
Coloque um tubo cônico de 50 mililitros contendo meio Neurobasal-A sem glicose no gelo. Rotule os tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro como falta de glicose, incubação de 6-NBDG, sonicação e coleta de amostras para o ensaio de perfuração. Adicione 100 microlitros de meio Neurobasal-A resfriado aos tubos de sonicação pré-rotulados no gelo.
Ligue o leitor de placas. Configure os parâmetros da placa no software do leitor de placas usando o recurso de ensaio de ponto final de fluorescência com excitação definida para 483 nanômetros, emissão definida para 550 nanômetros e corte definido para 530 nanômetros. Dilua a solução estoque de cinco milimolares de seis NBDG em meio neurobasal-A para preparar uma solução de trabalho de 500 micromolares e cubra-a com papel alumínio para protegê-la da luz.
Pipete 200 microlitros da solução de trabalho nos tubos de incubação 6-NBDG pré-rotulados e cubra conforme demonstrado. Depois de isolar a retina de um camundongo sacrificado usando uma pipeta de transferência aparada ou pinça, transfira a retina para um tubo de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de meio Neurobasal-A para falta de glicose. Incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos.
Transfira a retina para um tubo pré-rotulado contendo 200 microlitros de 500 micromolares 6-NBDG em meio neurobasal-A. Incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por 60 minutos. Para preparar os padrões 6-NBDG, rotule oito tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro como padrões de um a oito.
Para o padrão, pipete 32 microlitros de solução estoque de 6-NBDG 500 micromolares no tubo rotulado. Em seguida, adicione 368 microlitros de meio Neurobasal-A ao tubo e misture bem pipetando para cima e para baixo. Cubra todos os tubos com papel alumínio.
Após a incubação de 60 minutos com 6-NBDG, remova os tubos do banho-maria a 37 graus Celsius. Para lavar a retina, remova a solução de 6-NBDG usando uma pipeta sem perturbar o tecido retiniano e adicione 500 microlitros de meio Neurobasal-A fresco e gelado no gelo. Em seguida, usando uma pinça, transfira cuidadosamente a retina para os tubos de sonicação contendo o meio Neurobasal-A no gelo.
Usando uma pequena tesoura de dissecação, corte a retina em pedaços pequenos. Sonicar cada retina por cinco a 10 segundos a uma amplitude de 10 e imediatamente colocar o tubo de volta no gelo. Centrifugar as amostras a 21, 130 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius.
Transfira 100 microlitros de sobrenadante para uma placa de 96 poços. Insira a placa no leitor de placas. Selecione o ensaio de ponto final de fluorescência com comprimentos de onda especificados.
Execute o ensaio e salve os resultados. Após a execução, pipete as amostras da placa de 96 poços em tubos pré-marcados para o ensaio de perfuração. Usando os padrões de proteína de ensaio de perfuração pré-diluídos, adicione 10 microlitros de cada padrão em duplicata em uma placa inferior transparente de 96 poços.
Em seguida, transfira 10 microlitros de amostra para a placa. Adicione 150 microlitros de reagente de perfuração a todos os poços que contenham padrões ou amostras. Tampe o prato e misture em uma coqueteleira em velocidade média por um minuto.
Incube a placa em temperatura ambiente por cinco minutos. Insira a placa no leitor de placas e selecione o ensaio de ponto final de absorbância com um comprimento de onda definido para 660 nanômetros. Meça a absorvância dos padrões e amostras, salve os resultados e trace uma curva padrão para determinar o total de microgramas de proteína em cada amostra.
As medições de fluorescência da glicose mostraram um aumento na captação de 6-NBDG na retina de camundongos do tipo selvagem após 30 minutos de incubação, atingindo o pico em 60 minutos, seguido por uma diminuição nas unidades arbitrárias após 90 minutos. A adição do inibidor de GLUT1, bay 876, reduziu a captação de 6-NBDG em 24%, indicando o envolvimento de mecanismos independentes de GLUT1 na retina de camundongos do tipo selvagem.
