O isolamento e a cultura de fibroblastos primários derivados de tecido queloide são a base para novos estudos de queloides. Fibroblastos de tecido queloide podem ser facilmente adquiridos através deste protocolo, que pode fornecer uma fonte abundante e estável de células em laboratório para pesquisa de queloide. Comece usando pinças estéreis para colocar o tecido queloide em um tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros contendo 10 a 25 mililitros de PBS suplementado com 1% de PSA.
Enquanto isso, adicione quatro mililitros de solução PBS PSA a cada poço de uma placa de seis poços. Agora retire o tecido do tubo e lave duas vezes com solução de PBS PSA. Usando um par de pinças estéreis, transfira o tecido sequencialmente de um poço para o outro.
Em seguida, remova as camadas adiposa e epidérmica com tesoura cirúrgica, deixando a derme intocada. Use uma tesoura para dissecar a derme aparada em três a cinco pedaços de milímetros quadrados e transfira as peças para o próximo poço com um par de pinças estéreis. Lave as peças em solução PBS PSA.
Usando pinças esterilizadas, coloque de 10 a 30 pedaços de tecido da derme espaçados menos de cinco milímetros em placas de Petri. Coloque os pratos de cabeça para baixo em uma incubadora até os pedaços secarem e grude no prato. Em seguida, adicione sete mililitros de DMEM suplementado com 10%FBS e 1%PSA, e incube os pratos como antes.
Após três dias, substituir metade do sobrenadante por meio de cultura completo. Observar os fibroblastos diariamente sob aumento microscópico de 40X. Retirar os pedaços de tecido no meio de cultura quando os fibroblastos atingirem 90% de confluência.
Lave os fibroblastos em PBS e adicione dois mililitros de solução estéril de tripsina EDTA. Depois de incubar as células em uma incubadora umedecida, bata suavemente na placa de cultura e observe-a ao microscópio. Adicione dois mililitros de meio completo para terminar a digestão uma vez que a maioria das células se desprenderam.
Agora transfira a suspensão da célula para um tubo centrífugo estéril de 15 mililitros e centrifugue o tubo a 300G por três minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante cuidadosamente e ressuspenda o pellet celular em meio completo. Semeando os fibroblastos em uma placa de cultura celular de nove centímetros e incubar em uma incubadora umedificada.
Para realizar a análise de imunofluorescência após cultivar os fibroblastos em lamínulas redondas e incubá-los em anticorpos primários e secundários, adicionar 50 microlitros de solução de DAPI à lâmina de vidro para corar os núcleos celulares. Coloque as lamínulas lavadas sobre lâminas de vidro usando pinças. Finalmente, transfira as amostras para uma caixa escura úmida para microscopia fluorescente.
Crescimentos de fibroblastos do tecido foram observados cinco dias após o processamento. Os fibroblastos apresentaram altas taxas de proliferação e atingiram confluência após 10 dias. Os fibroblastos tinham corpos celulares alongados e fusiformes, os quais estavam alinhados em feixes em alta confluência.
A coloração por imunofluorescência retornou imunofluorescência vermelha positiva dos fibroblastos e imunofluorescência azul do núcleo celular. Os ensaios por citometria de fluxo mostraram positividade para CD90 em quase todos os fibroblastos. Este estudo descreveu um método otimizado e forneceu instruções claras para resolver os desafios existentes e aumentar a chance de sucesso para o isolamento e cultura de fibroblastos de queloide.
