Nosso método responde a perguntas-chave, como qual é a carga total de bactérias resistentes a antibióticos na amostra de água? Qual é a identidade dessas bactérias e quais são os diferentes tipos de características e genes resistentes a antibióticos que elas estão carregando? A vantagem do nosso protocolo é que ele pode detectar até mesmo bactérias que não podem ser cultivadas em laboratório, que constituem uma proporção significativa do total de bactérias na amostra de água.
Assim, teoricamente, nenhuma bactéria ou suas características resistentes são deixadas de fora. Essa técnica combinatória que envolve técnicas baseadas em cultura e independentes de cultura pode ser replicada e personalizada para qualquer amostra obtida de esgoto, efluência farmacêutica ou hospitalar, ambientes clínicos e não clínicos e muito mais. Junto com Devika, demonstrando os procedimentos experimentais estarão Harshali Shinde e Maitri Mishra, ambos pesquisadores seniores do meu laboratório.
Para começar, processe a amostra de água assepticamente, filtrando-a através de um pano de musselina estéril para remover qualquer material particulado. Em seguida, diluir em série a amostra de água filtrada para uma análise mais aprofundada. Para determinar a carga bacteriana total, colocar 100 microlitros das diluições adequadas da amostra de água filtrada nas placas de ágar R2A solidificadas e duplicadas e espalhar uniformemente.
Incubar todas as placas de propagação da amostra a 35 a 37 graus Celsius durante 48 horas. Após o período de incubação, conte as colônias e expresse a carga bacteriana total em unidades formadoras de colônias por mililitro. Para determinar a contagem bacteriana resistente a antibióticos, adicione os antibióticos separadamente em tubos contendo 20 mililitros de ágar R2A derretido estéril modificado aproximadamente a 40 graus Celsius.
Gire para misturar uniformemente e despeje em placas de Petri estéreis antes que o ágar se solidifique. Para o controle de qualidade e para verificar a eficácia dos antibióticos, espalhe 100 microlitros de suspensão bacteriana em seus respectivos antibióticos contendo placas modificadas em ágar R2A. Incube as placas a 35 a 37 graus Celsius por 48 horas e, em seguida, determine a contagem bacteriana.
Para preparar o molde de DNA dos isolados para PCR, usando um palito de dente estéril, pegue uma única colônia pura isolada do isolado crescendo em uma placa de Petri. Suspenda a colônia bacteriana em 100 microlitros de água destilada dupla estéril em um tubo de microcentrífuga e ferva-a em banho-maria fervente ou em banho seco por 10 minutos a 100 graus Celsius. Centrifugar a suspensão a 10 000 g durante dois minutos para peletizar os detritos e transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga estéril fresco para utilizar como molde de ADN bruto.
Para amplificar a região V3 do gene 16S rRNA por PCR, prepare 40 microlitros da mistura de reação em um tubo de PCR. Coloque o tubo no bloco térmico e execute o programa apropriado no termociclador de PCR. Para resolver e visualizar os amplificadores de PCR, misture 10 microlitros do produto de PCR amplificado em dois microlitros de tampão de carga de gel 6x e carregue essa mistura nos poços de um gel de agarose a 1,5%, juntamente com uma escada de DNA emparelhada de 100 bases para estimar o tamanho dos amplificadores.
Realize a eletroforese do gel no tampão do tanque TAE a 80 a 100 volts até que o corante de rastreamento funcione 3/4 do gel. Em seguida, visualize as bandas de amplificador sob um transiluminador UV. Para preparar o inóculo, inocular assepticamente uma única colônia isolada de resistência a antibióticos purificados usando uma alça estéril em dois mililitros de caldo de Luria-Bertani, ou LB, sem qualquer antibiótico e incubar a 37 graus Celsius a 80 rpm durante a noite.
No dia seguinte, adicionar 100 a 150 microlitros da cultura cultivada durante a noite a dois mililitros de caldo LB fresco não seletivo e incubar por duas a quatro horas até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja 0,4 a 0,5. Diluir a suspensão de cultura recém-cultivada usando solução salina estéril a 0,85% e misturar suavemente para distribuir as células uniformemente para atingir uma densidade de cultura equivalente a 0,5 McFarland padrão. Dentro de 15 minutos após a diluição, mergulhe um cotonete estéril no inóculo e remova o excesso de suspensão para evitar a inoculação excessiva das placas.
Em seguida, espalhe a cultura uniformemente na placa de ágar Mueller Hinton preparada, começando de cima e indo e voltando de ponta a ponta. Em seguida, gire a placa em 60 graus e comece a esfregar novamente. Para colocar os discos de antibióticos, use uma pinça esterilizada por chama e transfira assepticamente os discos de antibióticos para as placas de ágar inoculadas.
Pressione os discos suavemente para garantir o nível completo de contato com o ágar. Coloque o número apropriado de discos de antibióticos na placa de ágar, considerando o organismo o antibiótico usado e o tamanho da placa para evitar a sobreposição das zonas de inibição. Dentro de 15 minutos da aplicação do disco de antibióticos, inverta as placas e incube-as a 37 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, medir a zona de diâmetro de inibição em milímetros e interpretá-la de acordo com os valores de ponto de interrupção indicados pelo EUCAST. A carga bacteriana total na amostra de água foi de 3,0 x 10 para a nona UFC/mL, e a carga bacteriana resistente a antibióticos foi elevada. Os isolados culturais de resistência a antibióticos sequenciados pertenciam à família Enterobacteriaceae, sendo a maioria Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae.
Além disso, bactérias oportunistas raras também foram identificadas. O teste de suscetibilidade a antibióticos pelo método de difusão em disco mostrou um índice de Resistência Múltipla a Antibióticos de aproximadamente 0,2 para oito isolados, indicando um alto grau de resistência. No entanto, as espécies Comamonas e Arthrobacter não mostraram resistência a nenhum dos antibióticos testados.
Os isolados cultiváveis revelaram a presença de genes de resistência a antibióticos que codificam os fatores contra beta-lactâmicos, trimetoprim e aminoglicosídeos. A análise metagenômica do DNA para a diversidade bacteriana total levou à identificação de 50 filos, indicando a alta diversidade bacteriana onde Proteobacteria foi o filo mais dominante, consistindo das classes Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria e Gammaproteobacteria. Ao nível da ordem, Burkholderiales foi o mais prevalente, pertencente à classe das betaproteobactérias.
No nível geral, Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium e Comamonas foram algumas das bactérias abundantes. A análise de DNA metagenômica também revelou mais genes de resistência a antibióticos. Neste método, a etapa de diluição em série é crítica, pois qualquer erro pode levar a uma interpretação errada da UFC total e da carga bacteriana resistente a antibióticos.
Além disso, o diâmetro da zona de inibição deve ser medido cuidadosamente para interpretar corretamente se o isolado é resistente ou sensível. Usando esses protocolos, além da amostra de água, qualquer outra amostra, seja ela ambiental, alimentar ou clínica, pode ser estudada. Além disso, além das bactérias, outras populações microbianas em qualquer ecossistema também podem ser estudadas usando abordagens semelhantes.
