Falta uma compreensão completa do papel das células M na homeostase intestinal e na defesa imunológica, devido à raridade das células M no intestino. A diferenciação induzida das células M nas culturas derivadas de células-tronco intestinais humanas permitirá o estudo do desenvolvimento e funções das células M. Para revestir as membranas Transwell, coloque o número desejado de Transwells em uma placa de 24 poços, criando um sistema de duas câmaras.
Diluir a matriz extracelular, ou ECM, 25 dobras em soro fisiológico estéril frio. Em seguida, adicione 100 microliters de solução diluída a frio em cada câmara superior sobre a membrana. Cubra a placa de 24 poços com uma tampa, e coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecido a 37 graus Celsius por duas horas para permitir a solidificação do ECM na membrana.
Depois de duas horas, retire a placa da incubadora e coloque em uma capa de cultura de tecido. Usando pinças estéreis, inverta cada Transwell para remover suavemente a solução restante. Deixe as membranas secarem no capô com a tampa aberta enquanto as células estão sendo coletadas.
Remova a placa de enteróides ileais da incubadora e remova suavemente a mídia cultural de cada poço por aspiração de vácuo ou com uma pipeta. Para quebrar o ECM, adicione 500 microliters de gelo frio 0,5 milimil de EDTA a cada poço contendo enteróides ileais suspensos em ECM. Pipeta para cima e para baixo vigorosamente com uma pipeta P1000 fixada em 500 microliters para quebrar o ECM, liberando assim enteróides ileais na solução.
Colete a solução de cada poço em tubos cônicos de 15 mililitros. Pelota as células em uma centrífuga a 140G e quatro graus Celsius por cinco minutos. A pelota deve ser visível, mas pode ser facilmente desalojada, por isso remova lentamente o supernatante por aspiração de vácuo ou com uma pipeta.
Para digerir ligações de junção apertadas e quebrar os enteróides ileais em células únicas, resuspense a pelota em 500 microliters de trippsina de temperatura ambiente por cada cinco poços coletados. Usando uma pipeta P1000, pipeta para cima e para baixo para desagregar os aglomerados. Incubar os tubos em um banho de água de 37 graus Celsius por cinco minutos ou menos.
Adicione um mililitro de DMEM F-12 avançado com 10%FPS por 500 microliters de trippsina para inativar a trippsina. Pipeta para cima e para baixo com um P1000 definido em 500 microliters pelo menos 50 vezes contra o lado do tubo cônico para desagregar ainda mais aglomerados remanescentes em células únicas. Coloque um coador de células de 40 mícrons sobre um tubo cônico de 50 mililitros e adicione um mililitro de DMEM F-12 avançado com 10% FPS para molhar o coador celular.
Pipeta a suspensão celular única a partir do cônico de 15 mililitros no coador. Lave o coador com um mililitro de DMEM F-12 avançado com 10%FPS. Transfira as células que passaram pelo coador celular do tubo cônico de 50 mililitros para um novo tubo cônico de 15 mililitros.
Conte as células usando um hemócito. Centrifugar as células no novo tubo de 15 mililitros a 400G por cinco minutos em temperatura ambiente. A pelota de célula deve ser visível.
Remova cuidadosamente o supernatante com uma pipeta, salvando novamente o supernatante caso a pelota se desalojada. Resuspend a pelota celular no MCMGF plus com 10 micromolar Y27632. Certifique-se de que as membranas codificadas pelo ECM tenham secado totalmente conforme avaliado pelo olho.
Lave a câmara superior com 200 microliters de MCMGF plus. Em seguida, adicione 200 microliters de solução celular em cada câmara superior. Adicione 700 microliters de MCMGF plus com 10 micromolar Y27632 para cada câmara inferior.
Coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecido de 37 graus Celsius com 5% de CO2. Após um dia de crescimento, remova a mídia da câmara superior e substitua por 200 microliters de MCMGF fresco, além de evitar o crescimento de múltiplas camadas celulares. Uma vez que as monocamadas são aproximadamente 80% confluentes, geralmente entre os dias um a três pós semeadura, substitua a mídia basilateral por mídia de diferenciação para poços de controle, ou com mídia de célula M para poços de indução de células M.
Substitua a mídia na câmara superior por mídia de diferenciação para ambas as condições. Para verificar a diferenciação de células M pelo QRTPCR, primeiro remova a mídia das câmaras superior e inferior. Lave suavemente a câmara superior duas vezes com 300 microliters de PPS de temperatura ambiente.
Adicione 300 microliters de TRIzol a cada câmara superior e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Enquanto isso, rotule tubos de micro centrífugas para cada poço, e adicione 700 microliters de TRIzol a cada tubo. Coletar célula homogeneizar-se gentilmente subindo e descendo três vezes com um P1000, e transfira o conteúdo para tubos de micro centrífugas correspondentes.
Vórtice por cinco segundos para misturar. Mantenha as amostras em temperatura ambiente por mais três minutos e, em seguida, continue com protocolos QRTPCR padrão, ou armazene amostras a 80 graus Celsius negativos. Para verificar a diferenciação celular M por imunofluorescência, primeiro, remova a mídia da câmara superior.
Lave delicadamente duas vezes com 300 microliters de pbs de temperatura ambiente. Adicione 100 microliters de temperatura ambiente 4% PFA em PBS à câmara superior. Cubra a placa com papel alumínio e deixe ficar em pé por 25 minutos em temperatura ambiente.
Depois de remover o PFA, lave a câmara superior três vezes com 300 microliters de PBS de temperatura ambiente. Incubar as monocamadas com 100 microlitadores de 5%BSA dissolvidos em PBS por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente para bloquear as monocamadas antes de remover a solução. Prepare a solução de anticorpos primários GP2 em 1% de BSA em PBS a uma diluição de 1 a 100, e adicione 100 microliters por poço.
Manche por uma hora à temperatura ambiente no escuro, antes de remover a solução. Lave a câmara superior três vezes com 300 microliters de pbs de temperatura ambiente. Prepare uma solução de mancha secundária de phalloidin igg anti-rato de cabra fluorescente e DAPI, e adicione 100 microliters por poço.
Manchar por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Lave os poços três vezes com 300 microliters de PBS. Em seguida, coloque uma gota de cinco microliter de solução de montagem em um slide de vidro.
Retire o poço da placa 24 e inverta. Durante a remoção da membrana do Transwell, a membrana deve permanecer completamente plana. Colisões na membrana impedem uma vedação firme na lâmina de vidro, e podem afetar muito a qualidade da imagem.
Para garantir o sucesso, corte cuidadosamente a membrana do poço usando um bisturi afiado. Coloque a membrana com as células voltadas para a gota da solução de montagem na lâmina de vidro. Adicione 10 microliters de solução de montagem na parte superior e central da membrana, e coloque um deslizamento de tampa em cima para selar a membrana entre o deslizamento de vidro e o deslizamento da tampa.
Seque os slides à temperatura ambiente no escuro por 24 horas. As células M são detectadas pela expressão superficial de GP2 por imunofluorescentes. Tipicamente, em uma monocamada confluente, uma a cinco células M são observadas em um determinado campo de microscópio a ampliação de 40X por dias seis a oito pós-semeadura em amostras tratadas com RANKL e TNF alfa.
Nenhuma expressão GP2 é vista nas amostras não tratadas. A visão ortogonal do plano XZ sobreposta com uma sonda de faloínima mostra estruturas de actina ao redor de cada célula, e expressão GP2 na superfície apical das células M. Este modelo recapitula a baixa frequência das células M encontradas no intestino humano.
Para determinar se as células M desenvolvidas neste modelo são capazes de se ligar ao IgA, a presença de IgA em células M é visualizada usando um anticorpo secundário conjugado fluor que reconhece a cadeia pesada do soro humano IgA. As células M tratadas com IgA por uma hora têm IgA ligada à superfície apical, enquanto as células M em poços de controle que só foram tratadas com o anticorpo secundário para IgA, não têm sinal detectável. Além disso, o IgA se liga especificamente à superfície apical das células M, e não é encontrado vinculado a nenhuma célula sem mancha de superfície GP2.
Além disso, as células M têm um ato denso caracteristicamente mais curto em sua superfície apical. Mudar para RANKL TNF alfa complementado mídia de diferenciação quando as monocamadas são cerca de 80% confluentes, é fundamental para alcançar uma boa diferenciação de células M. Essa técnica permitirá aos pesquisadores explorar questões relacionadas ao desenvolvimento celular M, bem como interações de patógenos hospedeiros e estudos de transporte de drogas envolvendo células M.
