desempenham um papel fundamental na iniciação e execução usando modelagem molecular. Estudamos o efeito de modificações e mutações pós-tradução na estrutura e função da caspase. Descrevemos a abordagem da dinâmica molecular que dá uma visão da evolução da proteína, após a introdução de modificações estruturais no nível atômico.
Tal abordagem é um significado particular para a compreensão dos mecanismos que regulam a morte celular do programa e distúrbios associados e o desenvolvimento de novas terapias eficazes. Demonstramos capacidades de modelagem molecular com uma das ferramentas mais populares, Amber 20. Mas o protocolo apresentado também pode ser usado com as versões formais deste software.
O vídeo a seguir descreve instruções passo a passo sobre a preparação da estrutura da Caspase para simulação e a realização de uma investigação ascilica deste tipo selvagem de proteínas e formas modificadas. Para recuperar o banco de dados de proteína selecionado ou a estrutura P D B, use a lista suspensa de arquivos de download e clique no formato P D B. Remova observações e dados de conectividade e insira um cartão T E R entre cadeias de proteínas separadas no arquivo P D B.
Para preparar o modelo inicial, inicie o programa T-LEAP do pacote Amber Tools. Em seguida, carregue o campo de força F F 14 S B para descrever a proteína com mecânica molecular e os parâmetros para moléculas de água e íons atômicos, como sódio e cloreto, inserindo os comandos indicados na linha de comando. Em seguida, carregue o arquivo P D B e construa coordenadas para hidrogênios criando um objeto chamado mol.
Verifique se há inconsistências internas que possam causar problemas usando o comando check mol. Crie uma caixa de solvente ao redor da proteína. Em seguida, verifique a carga total inserindo mol de carga e adicione íons contadores para neutralizar o sistema.
Crie o arquivo de topologia P R M top e a coordenada I N P C R D digitando o comando indicado. Uma vez feito, feche o programa T-lEAP. Realizar o primeiro estágio da minimização de energia para otimizar as posições dos átomos de hidrogênio e moléculas de água adicionados, mantendo as coordenadas de proteína fixadas por restrições posicionais em átomos pesados.
Execute o programa P M E M D inserindo o comando indicado. Siga os argumentos necessários enquanto controlo os dados. P topologia molecular, parâmetros de campo de força e nomes de átomos.
Coordenadas iniciais C. O usuário legível log saída R coordenadas finais. REF, coordenadas de referência para restrições de posição.
Em seguida, realize o segundo estágio da minimização de energia sem restrições para otimizar todo o sistema usando as entradas do comando indicado. Esta etapa visa aquecer o sistema de zero a 300 kelvins. Realizar o processo de aquecimento com restrições posicionais nos átomos de proteína com 50 picossegundos em volume constante, usando o comando dado como entradas.
Siga o argumento necessário como X conjuntos de coordenadas salvos ao longo da trajetória da dinâmica molecular. O próximo estágio é necessário para ajustar a densidade da água e obter o estado de equilíbrio da proteína. Efectuar o equilíbrio a 300 kelvins durante 500 picossegundos a pressão constante, sem quaisquer restrições, utilizando o comando indicado após o equilíbrio ter sido alcançado com êxito.
Realizar uma simulação de dinâmica molecular de produção por 10 nanossegundos ou mais a pressão constante e gerar o arquivo de trajetória para posterior análise da estrutura proteica usando o comando indicado. A versão paralela do programa, P M E M D M P I ou G P U versão acelerada P M E M D cuda pode ser usada em clusters de computadores e supercomputadores. Uma longa simulação de dinâmica molecular pode ser dividida em vários segmentos e realizada sequencialmente.
Nesta análise, a Caspase dois do tipo selvagem e seu mutante Serina-384 alanina foram investigados seguindo o fluxo de trabalho de modelagem de dinâmica molecular. A substituição de serina-384 alanina induziu importante alteração conformacional no resíduo do sítio ativo Arginina-378. Além disso, foi demonstrado que a substituição de serina-384 alanina afetou o reconhecimento do substrato pelos resíduos de arginina no sítio ativo, prejudicando a atividade de base fundida.
A mutagênese direcionada ao local e os testes bioquímicos demonstraram que a mutação Serina-384 alanina bloqueou a atividade enzimática no processamento da Caspase dois e suprimiu a apoptose das células cancerígenas. A abordagem descrita pode ser usada para avaliar o efeito de mutações de aminoácidos e modificações pós-traducionais na caspase dois, bem como em outras caspase envolvidas em várias doenças cancerígenas.
