svolgono un ruolo chiave nell'avvio e nell'esecuzione utilizzando la modellazione molecolare. Studiamo l'effetto delle modifiche e delle mutazioni post-traduzione sulla struttura e la funzione della caspasi. Descriviamo l'approccio di dinamica molecolare che dà una visione dell'evoluzione della proteina, in seguito all'introduzione di modificazioni strutturali a livello atomico.
Tale approccio è un significato particolare per comprendere i meccanismi che regolano la morte cellulare del programma e i disturbi associati e sviluppare nuove terapie efficaci. Dimostriamo le capacità di modellazione molecolare con uno degli strumenti più popolari, Amber 20. Ma il protocollo presentato può essere utilizzato anche con le versioni formali di questo software.
Il seguente video descrive le istruzioni passo passo sulla preparazione della struttura della caspasi per la simulazione e l'esecuzione di un'indagine ascilica di questa proteina wild type e forme modificate. Per recuperare la banca dati delle proteine selezionata o la struttura P D B, utilizzare l'elenco a discesa dei file di download e fare clic sul formato P D B. Rimuovere le osservazioni e i dati di connettività e inserire una scheda T E R tra catene proteiche separate nel file P D B.
Per preparare il modello di partenza, avviare il programma T-LEAP dal pacchetto Amber Tools. Quindi caricare il campo di forza F F 14 S B per descrivere la proteina con la meccanica molecolare e i parametri per molecole d'acqua e ioni atomici come sodio e cloruro inserendo i comandi indicati nella riga di comando. Quindi, carica il file P D B e costruisci le coordinate per gli idrogeni creando un oggetto chiamato mol.
Verificare la presenza di incoerenze interne che potrebbero causare problemi utilizzando il comando check mol. Creare una scatola di solventi attorno alla proteina. Quindi controllare la carica totale inserendo la mola di carica e aggiungere ioni contatore per neutralizzare il sistema.
Creare il file superiore della topologia P R M e il file di coordinate I N P C R D immettendo il comando indicato. Una volta fatto, uscire dal programma T-lEAP. Effettuare la prima fase della minimizzazione dell'energia per ottimizzare le posizioni degli atomi di idrogeno aggiunti e delle molecole d'acqua mantenendo le coordinate proteiche fissate da restrizioni posizionali su atomi pesanti.
Eseguire il programma P M E M D inserendo il comando indicato. Seguire gli argomenti richiesti mentre controllo i dati. Topologia molecolare P, parametri del campo di forza e nomi degli atomi.
C coordinate iniziali. O Output del log leggibile dall'utente Coordinate finali R. REF, coordinate di riferimento per i vincoli di posizione.
Successivamente, eseguire la seconda fase della minimizzazione dell'energia senza restrizioni per ottimizzare l'intero sistema utilizzando gli ingressi del comando indicato. Questa fase mira a riscaldare il sistema da zero a 300 kelvin. Eseguire il processo di riscaldamento con restrizioni posizionali sugli atomi proteici con 50 picosecondi a volume costante utilizzando il comando dato come input.
Seguire l'argomento richiesto come set di coordinate X salvati sulla traiettoria della dinamica molecolare. La fase successiva è necessaria per regolare la densità dell'acqua e ottenere lo stato di equilibrio della proteina. Eseguire l'equilibrio a 300 kelvin per 500 picosecondi a pressione costante senza restrizioni utilizzando il comando indicato dopo che l'equilibrio è stato raggiunto con successo.
Effettuare una simulazione di dinamica molecolare di produzione per 10 nanosecondi o più a pressione costante e generare il file di traiettoria per la successiva analisi della struttura proteica utilizzando il comando indicato. La versione parallela del programma, P M E M D M P I o G P U versione accelerata P M E M D cuda può essere utilizzata su cluster di computer e supercomputer. Una lunga simulazione di dinamica molecolare può essere suddivisa in diversi segmenti ed eseguita in sequenza.
In questa analisi, la caspasi di tipo selvatico due e il suo mutante di serina-384 alanina sono stati studiati seguendo il flusso di lavoro di modellazione della dinamica molecolare. La sostituzione della serina-384 alanina ha indotto un importante cambiamento conformazionale nel residuo del sito attivo Arginina-378. Inoltre, è stato dimostrato che la sostituzione della serina-384 alanina ha influenzato il riconoscimento del substrato da parte dei residui di arginina nel sito attivo compromettendo l'attività della base colata.
La mutagenesi diretta dal sito e i test biochimici hanno dimostrato che la mutazione della serina-384 alanina blocca l'attività enzimatica nel trattamento della caspasi due e sopprime l'apoptosi delle cellule tumorali. L'approccio descritto può essere utilizzato per valutare l'effetto delle mutazioni aminoacidiche e delle modificazioni post-traduzionali nella caspasi due e in altre caspasi coinvolte in varie malattie tumorali.
