играют ключевую роль в инициировании и выполнении с использованием молекулярного моделирования. Исследуется влияние посттрансляционных модификаций и мутаций на структуру и функцию Каспазы. Описан подход молекулярной динамики, дающий представление об эволюции белка после введения структурных модификаций на атомном уровне.
Такой подход имеет особое значение для понимания механизмов, регулирующих программную гибель клеток и связанные с ней расстройства, и разработки новых эффективных методов лечения. Мы демонстрируем возможности молекулярного моделирования с помощью одного из самых популярных инструментов, Amber 20. Но представленный протокол также может быть использован с формальными версиями этого программного обеспечения.
В следующем видео описаны пошаговые инструкции по подготовке структуры Каспазы к моделированию и проведению исследования ацилики этого типа белков дикого типа и модифицированных форм. Чтобы получить выбранный банк данных белка или структуру P D B, используйте раскрывающийся список загрузки файлов и нажмите на формат P D B. Удалите замечания и данные о подключении и вставьте карту T E R между отдельными белковыми цепочками в файле P D B.
Для подготовки стартовой модели запустите программу T-LEAP из пакета Amber Tools. Затем загрузите силовое поле F F 14 S B для описания белка с молекулярной механикой и параметрами для молекул воды и атомных ионов, таких как натрий и хлорид, введя указанные команды в командной строке. Затем загрузите файл P D B и постройте координаты для водорода, создав объект с именем mol.
Проверьте наличие внутренних несоответствий, которые могут вызвать проблемы, с помощью команды check mol. Создайте коробку растворителя вокруг белка. Затем проверьте общий заряд, введя заряд mol и добавьте встречные ионы, чтобы нейтрализовать систему.
Создайте топологический файл P R M top и файл координат I N P C R D, введя указанную команду. После этого выйдите из программы T-lEAP. Проводят первый этап минимизации энергии для оптимизации положений добавленных атомов водорода и молекул воды, сохраняя при этом белковые координаты фиксированными позиционными ограничениями на тяжелых атомах.
Запустите программу P M E M D, введя указанную команду. Следуйте требуемым аргументам, когда я управляю данными. P молекулярная топология, параметры силового поля и названия атомов.
Начальные координаты C. O читаемый пользователем вывод журнала R конечные координаты. REF, контрольные координаты для позиционных ограничителей.
Далее проводят второй этап минимизации энергии без ограничений для оптимизации всей системы с помощью входов указанной команды. Этот этап направлен на нагрев системы от нуля до 300 кельвинов. Осуществляют процесс нагрева с позиционными ограничениями на атомах белка с 50 пикосекундами при постоянном объеме, используя данную команду в качестве входных данных.
Следуйте требуемому аргументу, так как наборы координат X сохраняются по траектории молекулярной динамики. Следующий этап необходим для корректировки плотности воды и получения равновесного состояния белка. Выполняйте уравновешивание при 300 кельвинах в течение 500 пикосекунд при постоянном давлении без каких-либо ограничений, используя указанную команду после успешного достижения равновесия.
Проводят моделирование молекулярной динамики производства в течение 10 наносекунд или более при постоянном давлении и генерируют файл траектории для последующего анализа структуры белка с помощью указанной команды. Параллельная версия программы P M E M D M P I или G P U ускоренная версия P M E M D cuda может использоваться на компьютерных кластерах и суперкомпьютерах. Моделирование длинной молекулярной динамики может быть разбито на несколько сегментов и выполнено последовательно.
В этом анализе дикий тип Caspase two и его аланиновый мутант Serine-384 были исследованы после рабочего процесса моделирования молекулярной динамики. Замещение аланина Серин-384 вызвало важные конформационные изменения в активном остатке аргинина-378. Кроме того, было показано, что замещение аланина Серин-384 влияло на распознавание субстрата остатками аргинина в активном центре, ухудшая активность литого основания.
Сайт направленного мутагенеза и биохимические тесты показали, что мутация аланина Серин-384 блокировала ферментативную активность при обработке Каспазы два и подавляла апоптоз раковых клеток. Описанный подход может быть использован для оценки влияния аминокислотных мутаций и посттрансляционных модификаций в каспазе две, а также в других каспазах, участвующих в различных онкологических заболеваниях.
