Juega un papel clave en la iniciación y ejecución utilizando modelos moleculares. Estudiamos el efecto de las modificaciones y mutaciones posteriores a la traducción en la estructura y función de la Caspasa. Describimos el enfoque de la dinámica molecular que da una visión de la evolución de la proteína, tras la introducción de modificaciones estructurales a nivel atómico.
Tal enfoque es de particular importancia para comprender los mecanismos que regulan la muerte celular del programa y los trastornos asociados y desarrollar nuevas terapias efectivas. Demostramos capacidades de modelado molecular con una de las herramientas más populares, Amber 20. Pero el protocolo presentado también se puede utilizar con las versiones formales de este software.
El siguiente video describe instrucciones paso a paso sobre la preparación de la estructura de Caspasa para la simulación y la realización de una investigación ascilica de estas proteínas de tipo salvaje y formas modificadas. Para recuperar el banco de datos de proteínas seleccionado o la estructura de P D B, use la lista desplegable de archivos de descarga y haga clic en el formato P D B. Elimine los comentarios y los datos de conectividad e inserte una tarjeta T E R entre cadenas de proteínas separadas en el archivo P D B.
Para preparar el modelo inicial, inicie el programa T-LEAP del paquete Amber Tools. Luego cargue el campo de fuerza F F 14 S B para describir la proteína con mecánica molecular y los parámetros para moléculas de agua e iones atómicos como el sodio y el cloruro ingresando los comandos indicados en la línea de comandos. A continuación, cargue el archivo P D B y cree coordenadas para hidrógenos creando un objeto llamado mol.
Compruebe si hay inconsistencias internas que puedan causar problemas con el comando check mol. Cree una caja de solvente alrededor de la proteína. Luego verifique la carga total ingresando charge mol y agregue iones contadores para neutralizar el sistema.
Cree el archivo superior de topología P R M y el archivo de coordenadas I N P C R D introduciendo el comando indicado. Una vez hecho esto, salga del programa T-lEAP. Llevar a cabo la primera etapa de la minimización de energía para optimizar las posiciones de los átomos de hidrógeno añadidos y las moléculas de agua mientras se mantienen las coordenadas de las proteínas fijadas por restricciones posicionales en los átomos pesados.
Ejecute el programa P M E M D introduciendo el comando indicado. Siga los argumentos requeridos mientras controlo los datos. P topología molecular, parámetros de campo de fuerza y nombres de átomos.
C coordenadas iniciales. O salida de registro legible por el usuario R coordenadas finales. REF, coordenadas de referencia para las restricciones de posición.
A continuación, realice la segunda etapa de la minimización de energía sin restricciones para optimizar todo el sistema utilizando las entradas del comando indicado. Esta etapa tiene como objetivo calentar el sistema de cero a 300 kelvins. Llevar a cabo el proceso de calentamiento con restricciones posicionales en los átomos de proteínas con 50 picosegundos a volumen constante utilizando el comando dado como entradas.
Siga el argumento requerido como X conjuntos de coordenadas guardados en la trayectoria de la dinámica molecular. La siguiente etapa es necesaria para ajustar la densidad del agua y obtener el estado de equilibrio de la proteína. Realice el equilibrio a 300 kelvins durante 500 picosegundos a presión constante sin restricciones utilizando el comando indicado después de que se haya alcanzado con éxito el equilibrio.
Realizar una simulación de dinámica molecular de producción durante 10 nanosegundos o más a presión constante y generar el archivo de trayectoria para su posterior análisis de la estructura de la proteína utilizando el comando indicado. La versión paralela del programa, P M E M D M P I o G P U versión acelerada P M E M D cuda se puede utilizar en clústeres de computadoras y supercomputadoras. Una simulación de dinámica molecular larga puede dividirse en varios segmentos y realizarse secuencialmente.
En este análisis, se investigaron la caspasa dos de tipo salvaje y su mutante serina-384 alanina siguiendo el flujo de trabajo de modelado de dinámica molecular. La sustitución de serina-384 alanina indujo un cambio conformacional importante en el residuo del sitio activo arginina-378. Además, se demostró que la sustitución de serina-384 alanina afectó el reconocimiento del sustrato por los residuos de arginina en el sitio activo que perjudican la actividad de la base fundida.
La mutagénesis dirigida al sitio y las pruebas bioquímicas demostraron que la mutación Serine-384 alanina bloqueó la actividad enzimática en el procesamiento de la Caspasa dos y suprimió la apoptosis de las células cancerosas. El enfoque descrito se puede utilizar para evaluar el efecto de las mutaciones de aminoácidos y las modificaciones postraduccionales en la caspasa dos, así como en otras caspasas involucradas en diversas enfermedades cancerosas.
