moleküler modelleme kullanılarak başlatma ve yürütmede önemli bir rol oynar. Çeviri sonrası modifikasyonların ve mutasyonların Kaspiz yapı ve fonksiyonu üzerindeki etkisini inceliyoruz. Atomik düzeyde yapısal modifikasyonların tanıtılmasını takiben, proteinin evrimi hakkında bir görüş veren moleküler dinamik yaklaşımını açıklıyoruz.
Böyle bir yaklaşım, program hücre ölümünü ve ilişkili bozuklukları düzenleyen mekanizmaları anlamak ve yeni etkili tedaviler geliştirmek için özel bir öneme sahiptir. En popüler araçlardan biri olan Amber 20 ile moleküler modelleme yeteneklerini gösteriyoruz. Ancak sunulan protokol, bu yazılımın resmi sürümleriyle de kullanılabilir.
Aşağıdaki videoda, Caspase yapısının simülasyon için hazırlanması ve bu proteinlerin vahşi tip ve modifiye formlarının ascilica araştırmasının yapılması ile ilgili adım adım talimatlar açıklanmaktadır. Seçilen protein veri bankasını veya P D B yapısını almak için, indirme dosyaları açılır listesini kullanın ve P D B formatına tıklayın. Açıklamaları ve bağlantı verilerini kaldırın ve P D B dosyasındaki ayrı protein zincirleri arasına bir T E R kartı takın.
Başlangıç modelini hazırlamak için Amber Tools paketinden T-LEAP programını başlatın. Daha sonra, komut satırında belirtilen komutları girerek proteini moleküler mekanikle ve su molekülleri ve sodyum ve klorür gibi atomik iyonlar için parametrelerle tanımlamak için F F 14 S B kuvvet alanını yükleyin. Ardından, P D B dosyasını yükleyin ve mol adında bir nesne oluşturan hidrojenler için koordinatlar oluşturun.
check mol komutunu kullanarak sorunlara neden olabilecek iç tutarsızlıkları denetleyin. Proteinin etrafında bir çözücü kutusu oluşturun. Ardından, şarj molünü girerek toplam şarjı kontrol edin ve sistemi nötralize etmek için sayaç iyonları ekleyin.
Belirtilen komutu girerek topoloji P R M üst dosyasını ve koordinat I N P C R D dosyasını oluşturun. İşiniz bittiğinde, T-lEAP programından çıkın. Eklenen hidrojen atomlarının ve su moleküllerinin konumlarını optimize etmek için enerji minimizasyonunun ilk aşamasını gerçekleştirirken, protein koordinatlarını ağır atomlar üzerindeki konumsal kısıtlamalarla sabit tutun.
Belirtilen komutu girerek P M E M D programını çalıştırın. Verileri kontrol ederken gerekli bağımsız değişkenleri izleyin. P moleküler topoloji, kuvvet alanı parametreleri ve atom isimleri.
C başlangıç koordinatları. O kullanıcı tarafından okunabilir günlük çıkışı R son koordinatları. REF, konum kısıtlamaları için referans koordinatları.
Ardından, belirtilen komutun girişlerini kullanarak tüm sistemi optimize etmek için enerji minimizasyonunun ikinci aşamasını kısıtlama olmadan gerçekleştirin. Bu aşama, sistemi sıfırdan 300 kelvin'e ısıtmayı amaçlamaktadır. Verilen komutu girdi olarak kullanarak sabit hacimde 50 pikosaniye ile protein atomları üzerinde konumsal kısıtlamalarla ısıtma işlemini gerçekleştirin.
X koordinat kümeleri moleküler dinamik yörüngesi üzerinden kaydedilirken gerekli argümanı izleyin. Bir sonraki aşama, suyun yoğunluğunu ayarlamak ve proteinin denge durumunu elde etmek için gereklidir. Denge başarıyla sağlandıktan sonra belirtilen komutu kullanarak sabit basınçta 500 pikosaniye boyunca 300 kelvin'de dengeyi herhangi bir kısıtlama olmadan gerçekleştirin.
Sabit basınçta 10 nanosaniye veya daha uzun süre bir üretim moleküler dinamik simülasyonu gerçekleştirin ve belirtilen komutu kullanarak protein yapısının daha sonraki analizi için yörünge dosyasını oluşturun. Programın paralel versiyonu, P M E M D M P I veya G P U hızlandırılmış versiyon P M E M D cuda bilgisayar kümelerinde ve süper bilgisayarlarda kullanılabilir. Uzun bir moleküler dinamik simülasyonu birkaç bölüme ayrılabilir ve sırayla gerçekleştirilebilir.
Bu analizde, moleküler dinamik modelleme iş akışını takiben vahşi tip Kaspaz iki ve Serin-384 alanin mutantı araştırılmıştır. Serin-384 alanin ikamesi, aktif bölge kalıntısı Arginin-378'de önemli konformasyonel değişikliklere neden oldu. Ayrıca, Serin-384 alanin ikamesinin, aktif bölgedeki arginin kalıntıları tarafından substrat tanımayı etkilediği ve döküm baz aktivitesini bozduğu gösterilmiştir.
Bölgeye yönelik mutagenez ve biyokimyasal testler, Serin-384 alanin mutasyonunun Kaspiz ikisinin işlenmesindeki enzimatik aktiviteyi bloke ettiğini ve kanser hücrelerinin apoptozunu baskıladığını göstermiştir. Tarif edilen yaklaşım, çeşitli kanser hastalıklarında rol oynayan diğer kaspazların yanı sıra iki kaspazdaki amino asit mutasyonlarının ve post-translasyonel modifikasyonların etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.
