Este método permitirá a caracterização de diferentes células imunes nos mesmos estados de doença de indivíduos com MI, o que ampliará nossa compreensão do mecanismo de infecção por EBV. Demonstrando o procedimento estará Linlin Zhang, um médico do nosso laboratório. Para começar, pegue os PBMCs isolados anteriormente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e gire-o a 300 G por 10 minutos à temperatura ambiente.
Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com 80 microlitros do tampão preparado. Em seguida, adicione 20 microlitros de microesferas CD 14 à suspensão celular, bem misturadas por pipetagem, e incube o tubo por 15 minutos no gelo. Em seguida, lave os PBMCs usando um mililitro de tampão e centrífuga a 300 G por 10 minutos à temperatura ambiente.
Descarte todo o sobrenadante e ressuspenda as células com 500 microlitros do buffer. Para separação magnética, coloque uma coluna no separador de contas magnéticas e prepare a coluna lavando-a com três mililitros do buffer. Em seguida, adicione a suspensão da célula à coluna.
Deixe-o passar e colete as células não rotuladas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Lave a coluna três vezes com três mililitros do tampão e colete todo o efluente em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Agora, coloque a coluna em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de buffer à coluna.
Empurre o êmbolo firmemente para dentro da coluna para liberar as células marcadas magneticamente no tubo. Centrifugar as células marcadas magneticamente a 300 G durante cinco minutos. Depois de remover o sobrenadante, ressuspeite as células em 500 microlitros de PBS e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para posterior sequenciamento do transcriptoma.
Pellet as células coletadas não marcadas por centrifugação a 300 G por cinco minutos, e ressuspender as células em 100 microlitros de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione dois microlitros de cada anticorpo marcado à suspensão celular e incube no gelo por 30 minutos, protegido da luz. Em seguida, alíquota de 100 microlitros da suspensão de células PBMC em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para configurar uma amostra de controle negativo CD 3, CD 4, CD 8 e CD 19, amostras de coloração única e uma amostra de coloração CD 56 ou CD 16.
Em seguida, adicione dois microlitros do anticorpo marcado fluorescentemente correspondente a cada tubo e incube no gelo por 30 minutos, protegido da luz. Após a incubação, lave todas as células com PBS, como demonstrado anteriormente, e ressuspeite em 500 microlitros de PBS. Abra o sistema de classificação de células e execute o programa power on.
Em seguida, instale o bocal de 85 micrômetros e abra o fluxo de classificação. Defina a tensão de classificação para 4, 500 volts e a frequência para 47. Configure o intervalo como 8 na janela de interrupção e ative o modo de classificação automática de ponto ideal para determinar o valor da amplitude do gota automaticamente.
Finalmente, ajuste o atraso da gota para 30,31 na janela de fluxo lateral. Usando um gráfico de pontos de dispersão para frente versus lateral, desenhe a porta do polígono P1 para identificar a população de linfócitos intacta. Em seguida, usando uma área de dispersão para frente versus gráfico de pontos de altura, desenhe a porta do polígono P2 para identificar as células individuais e exclua os dubletos.
Em seguida, usando uma área FITC CD 19 versus CD 3 por gráfico de pontos de área CPCY 5.5, desenhe a porta retangular P3 para selecionar células T positivas para CD 3 e células B positivas para CD 19. Em seguida, usando um gráfico de pontos de área APCCY 7 do CD 4 versus área do CD 8 PE, desenhe uma porta retangular para selecionar as células T positivas do CD 4 e do CD 8. Finalmente, usando uma área de dispersão lateral versus gráfico de pontos de área APC CD 56 ou CD 16, desenhe uma porta retangular para selecionar células natural killer positivas para CD 56 ou CD 16.
Para o tubo de controle negativo, clique em carregar no painel de aquisição e selecione as configurações do citômetro no software. Na janela do inspetor, clique na guia parâmetros e ajuste as tensões de dispersão para frente, dispersão lateral e corantes fluorescentes diferentes. Depois de carregar os tubos de coloração única no citômetro, clique em carregar no painel de aquisição e, em seguida, clique na guia de compensação para ajustar a compensação, conforme descrito no texto.
Vórtice a suspensão celular suavemente, antes de carregar o tubo no citômetro. Adicione 200 microlitros de FBS a quatro tubos de fluxo de coleta e vortex os tubos. Coloque-os na câmara de coleta do citômetro.
Colete os diferentes tipos de células separadamente nos quatro tubos de fluxo. Gire as células separadas a 300 G por cinco minutos e adicione 200 microlitros de reagente de isolamento de RNA à paleta celular para sequenciamento do transcriptoma. No presente estudo, subpopulações de células imunes de sangue periférico de diferentes amostras foram classificadas de forma eficiente, combinando as técnicas de esferas imunomagnéticas e triagem de células ativadas por fluorescência.
É importante ressaltar que, neste protocolo, a etapa de classificação de células foi otimizada para melhorar a viabilidade celular. As células imunes classificadas mostraram uma proporção aumentada de células T positivas para CD 3, CD 8 em pacientes com mononucleose infecciosa em comparação com os portadores saudáveis do vírus Epstein-Barr e amostras não infectadas. Em contraste, proporções diminuídas de células T positivas para CD 3, CD 4 e células B positivas para CD 19 foram observadas em pacientes com mononucleose infecciosa em comparação com portadores saudáveis de EBV e crianças não infectadas por EBV.
Além disso, foram observadas proporções diminuídas de células natural killer positivas para CD 56 ou CD 16 em pacientes com mononucleose infecciosa em comparação com crianças não infectadas por EBV. Manter a viabilidade celular é vital para experimentos subsequentes. Manter as células no gelo ou na geladeira durante o processo de classificação é benéfico para a viabilidade celular.
