A dissecção da mão do intestino deste elegan é uma técnica poderosa, mas simples, que permite a investigação de vários aspectos da pós-biologia, isolando o tecido em populações específicas de células. Esta técnica de dissecção de tecidos em escala fina é fácil de realizar e utiliza equipamentos de laboratório padrão, tornando-se um método robusto e acessível para muitos. Comece puxando o capilar de vidro padrão de 4 polegadas de comprimento e 1,2 milímetro de diâmetro externo em uma forma de agulha de injeção usando um puxador de agulha.
Preparar pelo menos 5 50 e 100 micrômetros micro pipetas capilares. Use uma micro forja para forjar as micropipetas capilares a 50 micrômetros ou 100 micrômetros, marcando 3 ou 5 marcas de seleção, respectivamente, conforme indicado pela régua ocular micro forja sob a lente objetiva 5X. Em seguida, afixe uma micropipeta capilar no tubo aspirador da boca.
Prepare um banho M9 e um banho tampão de dissecação adicionando 2 mililitros de M9 em uma placa de Petri estéril de 35 milímetros de diâmetro e 2 mililitros de tampão de dissecação à outra placa de Petri estéril de 35 milímetros de diâmetro. Finalmente, adicione 100 microlitros de albumina sérica bovina ou solução BSA a cada banho e misture girando. Para preparar a matriz de dissecção, adicione 150 microlitros de solução de levamisol de trabalho ao primeiro poço da lâmina de concavidade dos dois poços e 150 microlitros de tampão de dissecção ao segundo poço.
Adicione 20 microlitros de solução BSA funcional a cada poço. Para dissecar manualmente o intestino do verme CL2122 da caenorhabditis elegans, mova 20 vermes adultos do meio de crescimento do nematoide ou da placa NGM para o banho M9 usando uma picareta de verme. Em seguida, mova todos os 20 vermes do banho M9 para o banho tampão de dissecção.
Em seguida, mova lotes de 10 vermes do banho tampão de dissecção para o poço contendo solução de levamisol. Uma vez que o movimento do verme diminua rapidamente movê-los do poço de levamisol para o poço que contém o tampão de dissecção. Permita que os worms comecem a se mover um pouco no buffer de dissecação bem antes de iniciar a dissecção.
Sob um escopo de dissecação fluorescente, faça um corte logo atrás da faringe ou na frente do reto usando uma agulha hipodérmica para produzir um número igual de seções da metade média anterior e da metade posterior média do intestino. Enquanto espera por cerca de um minuto para que os intestinos extrudam ao máximo do corpo, adicione 50 microlitros de tampão de quelação ao poço para ajudar a reduzir a degradação do RNA. Para facilitar a extrusão intestinal, use a pipeta microcapilar de 100 micrômetros presa a um aspirador de boca e puxe o verme para dentro e para fora da pipeta.
Uma vez que um intestino é suficientemente extrudido use a agulha hipodérmica de calibre 27 para cortá-lo longe do resto do corpo e de qualquer gônada restante. Aspirar a secção dos intestinos utilizando a pipeta microcapilar e transferi-la para o tubo de microcentrífuga contendo o reagente de isolamento do ácido nucleico. Mantenha os intestinos isolados no gelo e repita o procedimento para os intestinos restantes.
Este método demonstrou o sucesso da dissecção e isolamento dos intestinos. O método também relatou isolamento de RNA e vigilância microbiana de intestinos isolados. Como os vermes CL2122 abrigavam o metal específico do intestino dois promotores fundidos à GFP, o intestino foi observado como um brilho verde sob o escopo de dissecação fluorescente.
A dissecção do verme adulto exibiu um intestino extrudado depois de fazer uma incisão primária logo atrás da faringe. A dissecção bem-sucedida de um segmento intestinal parecia livre de contaminantes visíveis, como detritos da gônada ou da carcaça. Em contraste, a dissecção malsucedida exibiu a gônada e a carcaça ligadas ao segmento intestinal.
Os rendimentos de RNA da dissecção da mão foram mais eficientes, pois a amostra final de 60 cortes do intestino total produziu aproximadamente 15 nanogramas de RNA total de alta qualidade. A desagregação de vermes e o isolamento de células intestinais por FACS foram menos eficientes, pois exigiram centenas de milhares de células intestinais para obter quantidades proporcionais de RNA total. A amplificação do DNA genômico microbiano total usando um ensaio de detecção panbacteriana mostrou que a amostra final de 40 seções do intestino total das regiões anterior, média e médio-posterior produziu a quantidade baixa, mas detectável, de cerca de 0,009 picogramas de DNA microbiano total.
A coisa mais importante a lembrar ao realizar este procedimento é não paralisar excessivamente os vermes antes da dissecção, pois isso pode inibir a extrusão intestinal máxima.
