O protocolo de isolamento da membrana plasmática em pequena escala e mGFPHis double tag, fornecem um método econômico, rápido, confiável e fácil para caracterizar proteínas de membrana no organismo modelo eucariótico, Saccharomyces cerevisiae. A maior vantagem dessa tecnologia é a facilidade e velocidade com que os níveis de expressão da proteína da membrana, as atividades da ATP e o detergente são mais adequados para sua purificação podem ser determinados. Esta tecnologia é muito amigável.
No entanto, um ponto importante a ser lembrado é a colheita de células como OD 600 de 2, o que garante baixa contaminação mitocondrial e as atividades mais altas possíveis de ATPase. Comece pré-culminando uma única colônia de leveduras em 10 mililitros de YPD médio a 30 graus Celsius por sete a oito horas a 200 rotações por minuto. Use 10 mililitros de pré cultura para inocular 40 mililitros de meio YPD fresco.
Em seguida, incubar as células a 30 graus Celsius durante a noite a 200 rotações por minuto até que a densidade celular atinja um OD 600 de um a três. No dia seguinte, colhem 40 unidades de densidade óptica, ou ODU, de células faciais logarítmicas por centrifugação a 4.200 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Re suspenda e lave as células com 40 mililitros de gelo frio estéril água dupla destilada.
Repita a lavagem usando um mililitro de água gelada com centrifugação entre as etapas de lavagem. Suspenda a pelota em um mililitro de água estéril gelada e transfira a suspensão celular para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro pré-resfriado no gelo. Células de colheita a 3.300 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius.
Aspire o supernatante e suspenda a pelota celular em 500 microliters de tampão homogeneizador recém-suplementado com um fluoreto de sulfa de metila de fenal de mililitro Neal, ou PMSF. Armazene a suspensão do celular a menos 80 graus Celsius até que use mais. Descongele as células no gelo por aproximadamente uma hora.
Em seguida, adicione contas de sílica geladas de 0,5 milímetros de diâmetro aos 500 microliters da suspensão celular para atingir um volume total de um mililitro. Para quebrar as células, o vórtice suspende a suspensão celular em intensidade máxima de agitação por um minuto, durante seis ciclos, com um período de resfriamento de três minutos no gelo após cada ciclo. Após o vórtice, faça um fino orifício na parte inferior do tubo com uma lâmina de bisturi aquecida e colete a célula quebrada homogeneizar em outro tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro gelado com um giro de baixa velocidade por 10 segundos.
Centrifugar a célula coletada homogeneizar a 5.156 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para remover detritos celulares. Transfira 450 microlitres de supernacidos em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro e adicione um mililitro de tampão homogeneizador frio estocido com um PMSF fresco mililitro. Para colher membranas plasmáticas centrifuugar a suspensão celular a 17.968 vezes G por uma hora a quatro graus Celsius.
Remova o supernatante e adicione 100 microliters de tampão homogeneizador recém-suplementado com um PMSF milimar. Em seguida, solte a pelota da membrana plasmática mexendo com a ponta de pipeta de 100 microliter e suspenda novamente a pelota repetindo tubos para cima e para baixo. Meça a concentração proteica da preparação da membrana plasmática com um kit de ensaio proteico compatível com tampões contendo o agente redutor e o detergente.
Armazene as membranas plasmáticas a menos 80 graus Celsius, ou mantenha-as no gelo para uso imediato. Despeje de quatro a cinco mililitros de gel de separação no aparelho de gel montado até dois centímetros do topo. Coloque cuidadosamente de um a dois mililitros de 0,1% SDS por cima e deixe o gel de poli acrilamida definir por 60 minutos em temperatura ambiente.
Após uma hora, remova a camada de 0,1% SDS do gel de separação polimerizado e enxágue o gel com água dupla destilada para remover traços de SDS. Despeje a mistura de gel de empilhamento no gel de separação. Coloque um pente no gel de empilhamento e remova quaisquer bolhas de ar ao redor do pente.
Em seguida, deixe o gel de empilhamento definir por 60 minutos à temperatura ambiente. Retire o pente e enxágue as ranhuras de gel com água. Coloque o gel no tanque de gel e encha o tanque de gel até o topo com tampão de corrida.
Misture de cinco a 10 microliters de amostras de membrana plasmática com volumes iguais de corante de carga de proteínas duas vezes e carregue imediatamente a mistura de amostras em ranhuras de gel individuais, submersas em tampão de corrida. Carregar marcadores de peso molecular de proteína na faixa de 10 a 245 Kilodalton em um slot separado para permitir a estimativa de tamanho de fragmentos de proteínas individuais. Realize a eletroforese de gel a 200 volts até que o corante azul de carga atinja a parte inferior do gel.
Examine o gel para fluorescência GFP em gel com um sistema de imagem de gel. Seguindo as proteínas fluorescentes de fixação de imagem em 10 a 20 mililitros de solução de fixação de gel de proteína por agitação suave do gel por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue as duas vezes por 10 minutos com 10 mililitros de água dupla destilada e coloque o gel em 10 mililitros de solução de mancha de Kumasi coloidal com agitação suave por uma hora à temperatura ambiente para visualizar bandas proteicas.
Para melhor visualização de bandas proteicas, desperche o gel uma ou duas vezes em 20 mililitros de água dupla destilada por uma hora antes de gravar imagens com o sistema de imagem em gel. Uma alta frequência de transformação de Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta foi alcançada com o controle positivo plasmídeo PS2. Não foram obtidos transformadores Eurocell Prototron para o controle negativo.
Cerca de 50 células URA prototrofo CDR1-mGFPHintfomucofoi obtido após incubação de células AD Delta Delta transformadas em placas CSM menos URA por três dias. Petite transformador que não pode crescer em placas de ágar YPG foram eliminados. CDR1-mGHPHis amostras com concentrações variadas foram quantificadas com fluorescência em gel.
As intensidades de fluorescência mGFP foram lineares sobre toda a faixa de concentração com fluorescência mínima de fundo. Variando a densidade celular indicou que quebrar 40 ODU de células produziu a mais alta qualidade de membranas plasmáticas com a maior atividade DE ATPase CDR1. No entanto, o rendimento das membranas plasmáticas aumentou proporcionalmente ao aumento das densidades celulares.
A capacidade de 31 detergentes com várias propriedades para solubilizar CDR1-mGHPHis de membranas de plasma bruto do Delta delta, células CDR1-mGHPHis foram testadas com a página SDS. Beta e alfa DDM E Fos-choline 13 foram os melhores detergentes para solubilizar CDR1-mGHPHis. No entanto, Fos-choline 13 causa hidrólise parcial de CDR1-mGHPHis.
A proteína da membrana plasmática bruta solubilizada com 1%de detergente foi separada usando um superos seis aumentou 10 300 coluna de exclusão do tamanho de GL. Cromatógramas de Maltosides e proteínas extraídas de GNL mostraram a maioria dos CDR1-mGHPHis iludindo como um pico gaussiano bem moldado em 15,5 milímetros CDR1-mGHPHis solubilizado com glicose contendo detergentes aludidos como um pico agregado ou ampla. Os picos mais altos para DDM indicaram que uma grande parte do DMN G solubilizado CDR1-mGHPHis pode ser desnaturado.
Nos cromatógramas FSCC para fos-colinas zwitterionic e dois detergentes não iônicos apenas Digitonin e deu um cromatógrafo semelhante ao DDM. Fos-choline 13 deu um pico simétrico em forma afiada, mas aludiu com um volume de elução significativamente menor do que o do DDM. A tag dupla otimizada também melhora o rendimento de purificação e ajudou a determinar a localização, o tráfico e a estabilidade térmica das proteínas de membrana.
A tecnologia de expressão heteróloga também pode ser usada na triagem de medicamentos de alto rendimento, e na caracterização detalhada de muitas outras proteínas de membrana.
