Um dos grandes desafios na engenharia de um tecido cardíaco humano inclui sua vascularização. Nosso laboratório desenvolveu um modelo in vitro do coração humano por células co-culminando encontradas in vivo. Estes incluem miócitos cardíacos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais cardíacas.
Juntas, essas células permitem a recapitulação do microambiente do coração humano, incluindo seus componentes moleculares, celulares e celulares extras. Nós os usamos em nosso laboratório para testar diferentes drogas para ensaios de toxicidade de drogas. Estes incluem a doxorubicina, uma conhecida droga cardiotóxica que afeta os corações humanos mesmo anos após seu tratamento.
Nós culturamos fibroblastos cardíacos, células endoteliais e miócitos separadamente antes de formar esferoides. Para cultivar cardiomiócitos, coletamos o frasco de menos 80 graus e aquecemos a 37 graus por quatro minutos em um banho de água. Em seguida, pulverizamos o frasco criogeno com 70% de etanol e movê-lo para um armário de bio-segurança.
Nós gentilmente coletamos a suspensão da célula e transferimos para um tubo Falcon de 15 mililitros. Coletamos um mililitro de meio de revestimento pré-alerta, enxaguamos o frasco criogênico uma vez e depois adicionamos ao tubo Falcon de 50 mililitros, uma gota de cada vez a cada quatro segundos. Enquanto adicione no meio de chapeamento, agite suavemente o tubo Falcão.
Com uma pipeta celular, colete sete mililitros de meio de revestimento e adicione-o suavemente ao tubo Falcon de 15 mililitros. Uma vez adicionado o volume final de meio de revestimento ao tubo Falcão, transfira a suspensão celular para os frascos de tecido codificado pela fibronectina. Finalmente, mova células para uma incubadora.
Depois de dois dias, coletamos os frascos de tecido da incubadora e verificamos a confluência celular sob o microscópio. Neste ponto, movemos o frasco para um armário de bio-segurança e removemos o meio de chapeamento. Nós enxágüemos suavemente as células com o mesmo meio de revestimento do frasco de tecido quatro ou cinco vezes.
Substituí-lo por meio de manutenção fresco e movê-los para uma incubadora por um a dois dias adicionais. No dia em que criamos enforcamentos de culturas, coletamos todos os três tipos de células da incubadora. Nós chip em células removendo a mídia.
Nós os enxágüemos com três mililitros de PBS. E finalmente adicionamos os chips nas células. Os frascos são então movidos para uma incubadora, e incubados por até cinco minutos.
Para gerar esferoides cardíacos, co-cultura 20.000 células por gota de enforcamento. Estes incluem 10.000 cardiomócitos, mil fibroblastos cardíacos e 5.000 células cardíacas interiores. Estes são co-cultivados em pendurar queda 384 placas de poço.
Eles são banhados usando nosso sistema de manuseio líquido. Também adicionamos PBS nas paredes laterais das placas de gota suspensas para evitar que as culturas sequem na incubadora. Mova cuidadosamente a placa de gota pendurada contendo células para a incubadora.
Entre três a quatro dias, o esferoide se formará. Coletamos a placa pendurada da incubadora e verificamos se os esferoides estão se formando dentro de cada poço. Como mostrado nestas imagens, temos um conjunto de esferoides dentro do centro de cada poço.
Uma vez formados, coletamos esferoides e os incorporamos em géis de colágeno. Uma ponta de pipeta é cortada por dentro para evitar danos esferoides. Esferoides são coletados e transferidos para um tubo Falcon de 50 mililitros onde são puxados juntos.
Nós giramos para baixo a suspensão esferoide a 300 G por cinco minutos para separá-los do meio. Usamos placas de 96 poços muradas escuras para imagem de esferoides, a mídia é removida ou substituída por um gel de colágeno em um tubo Falcon. Hidróxido de sódio é adicionado à suspensão do gel esferoide antes de serem banhados na placa de parede escura.
100 microliter de suspensão esferoide é adicionado em cada poço e incubado por 30 minutos a 37 graus. Drogas, incluindo doxorubicina e outros agentes são adicionadas à placa esferoide e incubadas por 24 horas. No dia seguinte, preparamos uma solução contendo AM de cálcio e homodimer de ethidium, rotulando ao vivo sob as células, respectivamente.
Esta solução é preparada para adicionar o centavo a esta placa de filtro. Os spheróides são então incubados a 37 graus por uma hora. Usamos um leitor de placas para medir a fluorescência do M de cálcio e seu homodimer de ethidium na placa.
Essas medidas são então usadas pelo nosso software para realizar uma análise estatística. Medimos a atividade contratil de esferoides tratados com as diferentes drogas usando um sistema óptico de íons. Esferoides são movidos para o estágio entre dois eletrodos.
Isso permite controlar e medir a atividade contraída por campo. Desta forma, podemos testar diferentes tensões e faixas de frequência para estimular esferoides. Um esferoide na época é imageado e usado para essas medidas.
Esferoides que não receberam doxorubicina serão capazes de construir após a estimulação elétrica. Pelo contrário, os esferoides tratados com doxorubicina não serão contraíram. Para visualizar a forma de rede celular endotelial dentro de cada eferóide, nós os fixamos com uma solução de 4% de paraformaldeído por uma hora a temperatura ambiente.
Mudamos a placa para um agitador que permite a suave permeação da solução através do gel. O PFA é removido e enxaguado três vezes com uma solução PBS contendo 0,01% de óxido de sódio. Trouxemos mobilização, claro, adicionando uma solução de 0,02% do Triton X em PVSA por 20 minutos em temperatura ambiente.
A solução de bloqueio contém 3%BSA em PBC, que é então adicionado à placa por uma hora à temperatura ambiente. Uma solução contendo o anticorpo primário contra o CD 31. Um marcador para endotelial é adicionado à placa que é então incubada durante a noite a quatro graus.
No dia seguinte, a solução de anticorpos primários é removida e a placa enxaguada três vezes com uma solução PBS contendo 0,01% óxido de sódio. A solução de anticorpos secundários contendo a mancha de hexa, também é adicionada à placa que é então incubada durante a noite a quatro graus. Finalmente, a segunda solução de anticorpos é removida e a placa enxaguada três vezes com uma solução PBS contendo 0,01% óxido de sódio.
Depois de ficar com anticorpos primários e secundários, a placa pode ser imageda usando nosso microscópio confocal. Uma rede vascular adequada é fundamental para a sobrevivência e função das células cardíacas. Os esferoides cardíacos apresentam uma rede de células endoteliais que melhor recapitula a presente no coração humano em comparação com as culturas monocamadas das células cardíacas.
Dadas as características únicas, os esferoides cardíacos representam ferramentas avançadas para testes in vitro para pesquisa cardiovascular.
