Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo das proteínas fluorescentes, como como as proteínas fluorescentes podem afetar seus parceiros de fusão. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma avaliação rápida e facilmente escalável dos efeitos das proteínas fluorescentes e seus parceiros de fusão. Embora este método possa fornecer informações sobre o comportamento da proteína fluorescente, ele também pode ser aplicado a outras tags geneticamente codificadas.
Também demonstrando esse procedimento estará Sonja Di Gregorio, que é estudante de pós-graduação na Western University. Cada proteína fluorescente testada por este método é primeiramente clonada em um vetor de expressão de levedura que codifica uma versão indutível galactose de exon HTT marcado por BANDEIRA, abrigando a repetição não tóxica do 25Q ou a repetição tóxica 72Q associada à Doença de Huntington. Os clones são selecionados e verificados por sequenciamento e posteriormente transformados em leveduras.
Para preparar culturas celulares para os vários ensaios, listrar os clones de levedura carregando etiqueta 25T ou 72Q com uma proteína de fluorescência de interesse em uma placa de ágar contendo meio de seleção de leveduras com glicose como fonte de carbono. Ao mesmo tempo, a levedura de raia carregando leveduras 25Q ou 72Q otimizada superpatos monoméricas GFP para servir como um controle positivo. Incubar as placas a 30 graus Celsius por dois a três dias.
Selecione até as três colônias únicas de cada placa e inocula cinco mililitros de meio completo sintético suplementado com 2% de glicose como fonte de carbono. Incubar as culturas a 30 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, transfira 200 microliters de cada cultura durante a noite para um tubo de microcentrifuuagem e centrífuga para pelotar as células.
Lave pelo menos três vezes com água destilada estéril. É importante lavar bem as células para eliminar todos os traços de glicose que poderiam contribuir para reprimir a indução do promotor GAL1. Prepare as células como demonstrado anteriormente e suspenda-as em meio sintético completo contendo 2% de galactose como fonte de carbono para induzir a expressão de fusões de poliq.
Como controle, suspenda as células em mídia contendo glicose. Incubar as células a 30 graus Celsius em um rotador de tubo durante a noite. Na manhã seguinte, meça a densidade óptica em 600 nanômetros de cada cultura usando um espectrofotômetro.
Equalize as densidades celulares a uma densidade óptica de 600 de 2 em 100 microlitres de meio sintético completo em uma placa estéril de 96 poços. Prepare quatro diluições de cinco vezes de cada amostra, pipetando 20 microliters da amostra do poço anterior em 80 microliters de mídia no próximo poço. Use uma ferramenta de fixação de levedura para detectar as células em placas seletivas e incubar a 30 graus Celsius por dois dias.
Imagem das placas com um dispositivo de documentação de imagem. Prepare as culturas celulares para este ensaio e, em seguida, meça o OD600 de cada cultura usando um espectrofotômetro. Diluir as células para um OD600 de 1 em 300 microliters de mídia na placa de 96 poços.
Prepare cada amostra em triplicado. Incubar a placa em uma incubadora leitora de placas com capacidades de agitação. Defina o número de amostras, a temperatura em 30 graus Celsius, a absorvância em 600 nanômetros, o comprimento dos experimentos para 24 horas, e os intervalos de medição para 15 minutos.
Selecione o modo de agitação contínua. Quando o experimento é feito, crie a curva de crescimento e quantifique a área sob a curva usando software de gráficos científicos. Cole os dados em uma tabela XY com três valores de replicação.
A curva de crescimento será mostrada sob a pasta de gráficos no lado esquerdo. Para quantificar a área sob a curva, selecione analisar no canto superior esquerdo e clicar na área sob curva em análises XY. Inicie este procedimento diluindo as células preparadas 10 vezes em meio de crescimento.
Transfira 200 microliters de cada amostra para uma câmara de imagem de oito poços. Imagem das células usando um microscópio fluorescente de campo amplo padrão. Ajuste as configurações de imagem para aquisição de imagens.
Uma vez que os agregados 72Q são muito mais brilhantes do que o sinal 25Q difundido, muitas vezes é necessário usar um ajuste de aquisição diferente entre os diferentes plasmídeos, a fim de evitar a saturação do sinal fluorescente. Processe as imagens usando um software adequado de processamento de imagens. Neste protocolo, a mancha de ponto é usada para examinar os níveis de expressão proteica.
Prepare o tampão para gerar lisesicas adicionando quatro micromolar de flúor de fenilmetilsulfonil e um coquetel inibidor de protease ao tampão de lise. Pellet cinco mililitros de cada cultura da noite para o dia por centrifugação. Suspenda as células em 200 microliters de contas de vidro e 200 microliters de tampão de lise.
Vórtice por 30 segundos por 12 rounds, congelando entre as rodadas. Centrifugar a 12.000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos e coletar o supernaspe. Use um aparelho de microfiltração para detectar quantidades iguais de proteína total em uma membrana de nitrocelulose.
Pré-molhar a membrana com PBS e montar o aparelho. Conecte-o a uma fonte de vácuo e certifique-se de que os parafusos estão apertados. Carregue as amostras, ligue o vácuo e deixe a amostra filtrar através da membrana por gravidade.
Borrite a membrana em PBS 05%Tween 5% leite sem gordura por 30 minutos. Incubar a membrana com anticorpo anti-bandeira primário a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave a membrana três vezes por 10 minutos cada com PBS 05%Tween.
Incubar a membrana com um anticorpo secundário rotulado fluorescentemente em PBS 05%Tween 5% de leite livre de gordura à temperatura ambiente por uma hora. Lave a membrana três vezes por 10 minutos cada com PBS 05%Tween. Posteriormente, imagem a membrana usando um sistema de documentação amino blot.
Levedura expressando exon 25Q ou 72Q HTT um fundido à superpatos monomérica otimizada de levedura GFP ou marca monomérica otimizada de levedura BFP2 foi cultivada em glicose ou meio galactose durante a noite e ou manchada em placas de ágar ou incubada ainda mais em mídia líquida. Enquanto a levedura 72T otimizada superpatos monomérica GFP induz um defeito significativo de crescimento. A marca monomérica otimizada de levedura 72Q BFP2 exibe um fenótipo de crescimento semelhante às contrapartes não tóxicas do 25T indicando que a natureza da tag fluorescente pode impedir o comportamento de expansão do polq nas células.
A avaliação da agregação das fusões de poliQ fluorescentes por microscopia fluorescente mostra que a superpatosa monomérica 72Q otimizada GFP exibe agregação significativa, enquanto a tag monomérica otimizada de 72Q BFP2 exibe um sinal citoplasmático difuso semelhante às contrapartes não tóxicas do 25T. Uma vez que os níveis de expressão das várias fusões de QI poderiam afetar a toxicidade, manchas de pontos foram realizadas para avaliar os níveis de proteína. Os resultados das diluições cinco vezes dos lises celulares são mostrados.
Não se esqueça que essa técnica permite uma comparação rápida de proteínas não caracterizadas e fluorescentes com as variantes GFP, mas não pode avaliar diretamente a oligomerização. Após esse procedimento, outras medidas, por exemplo, o ensaio de úlcera em células mamíferas podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como o status monomérico das proteínas fluorescentes.
