Este protocolo permite aumentar o número de neurônios em culturas de gânglios da raiz dorsal de camundongos adultos. Isso pode ajudar a determinar a contribuição das células neuronais para uma dada resposta. Adicionamos uma etapa de imunopanning a um protocolo básico de cultura DRG.
A principal vantagem é selecionar contra células não neuronais. Se você é novo nas culturas DRG primárias, é melhor praticar dissecações para obter o maior número possível de DRGs e cortar o máximo possível do nervo. Para começar, aspirar a poli-D-lisina usada para revestir a placa de cultura e lavá-la três vezes com água de cultura de tecido.
Incline a tampa e deixe a superfície secar completamente. Aplique laminina suficiente na placa para revestir o fundo de cada poço e coloque-a em uma incubadora a 37 graus Celsius. Lave as placas de movimento panorâmico previamente preparadas de CD45, PDGFR-beta e O4 com D-PBS.
Para a placa CD45, adicionar 5 mililitros de BSA 0,2% e 20 microlitros de anticorpo primário CD45. Para a placa PDGFR-beta, adicione 15,2 microlitros de PDGFR-beta aos 5 mililitros de placa contendo 0,2% de BSA. Para o prato de O4, adicione 2 mililitros de hibridoma de O4 a 3 mililitros de BSA 0,2% e mais 100 microlitros de BSA 4%, para garantir que a concentração final de BSA permaneça em 0,2%Em seguida, perfunda o camundongo eutanasiado com 30 mililitros de solução salina gelada a 0,9%.
Observe a mudança na cor do fígado para garantir a perfusão. Fixe as patas dianteiras e traseiras em um estágio de isopor e use uma lâmina de barbear limpa para expor a coluna vertebral pelas costas. Realizar uma laminectomia fazendo cortes na metade do caminho profundo em cada lado da coluna dorsal, removendo a metade dorsal da coluna para expor a medula espinhal.
Ou suavemente cortar os nervos e remover a medula espinhal, ou empurrar suavemente a medula para o lado, mantendo a integridade nervosa. Sob um microscópio de dissecção, use as raízes nervosas espinhais para encontrar e remover todos os gânglios da raiz dorsal, ou DRGs, de ambos os lados da coluna vertebral. Corte os debris nervosos de cada DRG à medida que ele é removido, uma vez que mais debris nervosos na cultura podem levar a uma baixa sobrevivência.
Colete os DRGs em 15 mililitros de HBSS em um tubo cônico sobre gelo e deixe-os se acomodar no fundo. Usando uma pipeta, aspirar a maior parte do HBSS dos DRGs, e deixar aproximadamente 100 microlitros de líquido no tubo, para evitar a perda do tecido. Lave três vezes com 1 mililitro de HBSS e adicione 5 mililitros de solução STEMxyme de trabalho previamente descongelada ao tecido.
Cubra a tampa com uma película transparente e flutue o tubo de lado em banho-maria a 37 graus Celsius, por uma hora. Após a incubação com a enzima, adicione 1 mililitro de solução inibidora de ovomucoide baixa ao tubo. Triture as células suavemente com uma pipeta P1000 de 10 a 15 vezes e deixe os pedaços de tecido se acomodarem.
Em seguida, transfira os 2 a 3 mililitros superiores da solução contendo células dissociadas para a solução ovomucoide baixa e fresca e repita até que o tecido esteja totalmente dissociado e não restem pedaços visíveis. Centrifugar o tubo durante 10 minutos a 300 x g à temperatura ambiente. Depois de remover o sobrenadante usando uma pipeta, como demonstrado anteriormente, ressuspenda o pellet de célula em 1 mililitro de tampão panorâmico e pipete suavemente para misturar.
Pré-molhar um filtro de células de 70 micrômetros com 1 mililitro de tampão panorâmico sobre um tubo cônico de 50 mililitros e, em seguida, filtrar a solução celular através do filtro celular. Lave o tubo com 1 mililitro de tampão panorâmico e passe-o pelo filtro. Para camadas celulares, adicione 2 mililitros de 15% BSA e cubra suavemente as laterais do tubo fechado.
Para remover os detritos de mielina, coloque cuidadosamente a suspensão celular um mililitro de cada vez, pipetando contra a lateral do tubo, em cima da almofada BSA. Centrifugar o tubo a 300 x g por 10 minutos à temperatura ambiente, com aceleração e desaceleração lentas. A camada média de mielina apresenta flocos de material branco.
Usando uma pipeta P1000, remova o líquido claro por cima, a fase de mielina no meio, e o BSA, um mililitro de cada vez, deixando aproximadamente 100 microlitros para não perturbar o pellet. Para recuperação de antígeno, adicione 5 mililitros de tampão panorâmico e incube o tubo em uma incubadora de 37 graus Celsius e 10% de dióxido de carbono por 30 a 45 minutos. Em seguida, lave a placa CD45 incubada três vezes com D-PBS e despeje o enxágue final.
Em seguida, despeje a suspensão de células no prato CD45. Incubar o prato por 20 minutos à temperatura ambiente, girando suavemente em intervalos de 10 minutos para permitir que as células obtenham acesso igual ao anticorpo. Agite suavemente o prato CD45 e apoie-o em um ângulo.
Pipetar cuidadosamente 1 mililitro da suspensão celular sobre o prato, para coletar células não ligadas. Em seguida, transfira-o para a placa PDGFR-beta, previamente lavada três vezes com D-PBS, e incube. Transfira as células não ligadas da placa PDGFR-beta para a placa de O4, como demonstrado anteriormente, e incube a placa.
Após a incubação, transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugar a 300 x g por 10 minutos. Ressuspender as células no volume desejado e diluir na proporção de 1:1 com azul de tripano para viabilidade celular. Usando um hemocitômetro, conte as células médias a grandes.
Retire a laminina e plaqueie imediatamente as células na densidade desejada, sem deixá-las secar antes de incubar a placa. As culturas DRG fixa, integral e imunopanizada foram coradas com beta3-tubulina para neurônios e DAPI para todos os núcleos. Culturas DRG inteiras foram determinadas como tendo aproximadamente 42,36% de coloração de beta3-tubulina, e culturas de DRG imunopanned foram determinadas para ter aproximadamente 71,44% de coloração de beta3-tubulina, o que revela um aumento significativo no enriquecimento neuronal com immunopanning.
Tratar o tecido com cuidado é muito importante. Manusear DRGs suavemente, aparar o excesso de nervo e tomar cuidado para não agitar ou perder tecidos e cultura são cruciais para estar ciente.
