Este protocolo pode ser usado para formular nanopartículas lipídicas consistentes encapsulando ARM. Os parâmetros de formulação podem ser ajustados e as várias nanopartículas lipídicas podem ser avaliadas quanto à sua potência e biodistribuição. Um protocolo padronizado para formulação de nanopartículas lipídicas e testes in vitro e in vivo pode ser usado para formular nanopartículas lipídicas consistentes que podem ser comparadas entre si.
Há muitos pequenos detalhes a ter em mente ao formular e avaliar a potência das nanopartículas, mas quais detalhes foram contabilizados? O preparo da formulação não deve ser difícil. Comece enchendo um copo limpo de quatro litros com 200 a 300 mililitros de PBS 10X fresco e diluindo-o para 1X com água ultrapura.
Certifique-se de que o volume final de PBS esteja entre dois e três litros. Coloque de diálise da capacidade apropriada para a nanopartícula lipídica, ou formulação LNP, no copo de campo. Faça a diluição de dez vezes de um estoque tampão de ácido cítrico de 100 milimolares usando água ultrapura para criar um tampão de ácido cítrico de 10 milimolares para diluição de mRNA.
Em seguida, faça C 12 200 lipídio ionizável, lipídio auxiliar, colesterol e soluções estoque de PEG ou PEG lipídico ancorado a lipídios, dissolvendo cada lipídio em etanol a 100%. Certifique-se de que as soluções de estoque estejam totalmente dissolvidas aquecendo-as e misturando-as a 37 graus Celsius. Combinar os volumes calculados dos diferentes componentes lipídicos em um tubo cônico.
Diluir os lipídios com 100% de etanol até o volume final de V, que representa 25% do volume final do LNP. Calcular a quantidade de mRNA necessária para a formulação com base na relação entre o peso do lipídio ionizável e do mRNA e o volume total de mRNA-LNP. Em seguida, descongele a luciferase do vagalume que codifica o mRNA no gelo.
Em seguida, diluir o RNAm para um volume final três vezes a fase orgânica usando o tampão de ácido cítrico de 10 milimolares. Borrife uma limpeza de tarefa delicada com uma superfície descontaminante para RNAs e DNA, e limpe o interior do instrumento microfluídico completamente. Em seguida, abra um novo cartucho microfluídico e insira-o com os canais de entrada voltados para baixo e para longe.
Disponha dois tubos cônicos estéreis de 15 mililitros no suporte com as tampas desligadas. Uma vez feito, encha uma seringa de cinco mililitros com a solução de mRNA contendo mRNA diluída em tampão de ácido cítrico de 10 milimolares. Em seguida, encha uma seringa de três mililitros com a solução lipídica contendo os lipídios diluídos em etanol 100%.
Certifique-se de remover qualquer ar das seringas. Em seguida, sem a agulha, insira a seringa de cinco mililitros contendo a solução de mRNA na entrada esquerda do cartucho e insira a seringa de três mililitros contendo a solução lipídica na entrada direita do cartucho. Ligue o instrumento microfluídico e selecione a execução rápida.
Depois de selecionar os tipos de seringas corretos para as seringas de cinco e três mililitros inseridas, insira os parâmetros para a formulação do LNP em uma relação de fluxo aquoso para orgânico de três para um, antes de pressionar o botão de início para formular os mRNA-LNPs. Carregar os mRNA-LNPs coletados no tubo cônico direito nos de diálise previamente hidratados usando uma seringa sem puncionar ou tocar a membrana do, colocar os de diálise contendo os mRNA-LNPs de volta no copo contendo PBS e deixá-los dialisar por pelo menos duas horas. Após a diálise, traga as de diálise contendo os mRNA-LNPs para um gabinete de biossegurança estéril e remova os mRNA-LNPs usando uma seringa com uma agulha.
Filtrar os RNAm-LNPs estéreis usando um filtro de seringa de 0,22 micrômetro e coletá-los em um tubo cônico estéril. Em seguida, coloque 65 microlitros da solução de mRNA-LNP em um microtubo de 1,5 mililitro para caracterização. Placa 5.000 células HepG2 em uma parede branca, fundo claro, placa de 96 poços em 100 microlitros de meio de cultura celular completo e incubar as células durante a noite em uma incubadora controlada a 37 graus Celsius contendo 5% de dióxido de carbono.
Antes do tratamento das células com mRNA-LNPs, remova o meio completo dos poços. Em seguida, tratar as células com 100 microlitros de mRNA-LNPs diluídos em meio de cultura celular completo nas doses desejadas, ou 100 microlitros de meio completo antes de uma incubação de 24 horas. Após a incubação, retirar o meio de cultura celular da placa de 96 poços, adicionar 20 microlitros de tampão de lise a cada poço seguido de 100 microlitros dos reagentes de ensaio de luciferase.
Proteja a placa da luz e coloque-a em um leitor de placas para medir o sinal bioluminescente. Diluir a solução de mRNA-LNP usando PBS estéril para que dois microgramas de mRNA total estejam presentes em 100 microlitros do volume de injeção da veia caudal. Encha uma seringa de insulina calibre 29 com 100 microlitros de mRNA-LNP ou 100 microlitros de PBS e remova quaisquer bolhas da seringa.
Insira a agulha com o bisel voltado para cima na veia lateral da cauda do rato e injete lentamente os 100 microlitros de mRNA-LNP ou PBS. Seis horas após a injeção, prepare uma solução estoque de 15 miligramas por mililitro de sal de potássio D-Luciferina em PBS estéril. No software de imagem para o sistema de imagem in vivo, ou IVIS, selecione a caixa ao lado de luminescência antes de pressionar inicializar para preparar o instrumento para aquisição de dados.
Em seguida, administrar 200 microlitros de D-Luciferina por via intraperitoneal aos camundongos previamente tratados e aguardar 10 minutos enquanto o sinal da luciferase se estabiliza antes de anestesiar os camundongos. Transfira os camundongos anestesiados para os cones nasais dentro do sistema de imagem in vivo, garantindo que eles estejam de costas com o abdômen exposto, antes de fechar a porta da câmara. No software de imagem, certifique-se de que o campo de visão correto está selecionado e defina o tempo de exposição como automático, clique no botão adquirir no software para obter imagens de bioluminescência.
A eficiência de encapsulação do mRNA-LNPs foi determinada em 92,3% usando o ensaio de fluorescência modificado e a equação mostrada aqui. Bioluminescência crescente foi observada após o tratamento de 5.000 células HepG2 com doses crescentes de mRNA-LNP. A expressão de Luciferase foi facilmente detectada na dose mais baixa deste estudo, de cinco nanogramas por poço.
Um forte sinal de bioluminescência foi observado no abdome superior dos camundongos tratados com LNPs formulados. Regiões de interesse foram desenhadas ao redor dos sinais hepáticos para calcular o fluxo luminescente total. O fluxo luminescente total foi de aproximadamente cinco vezes 10 até o 9º.
Mantenha sempre a relação lipídio/peso de ácido nucleico ionizável ao formular LNPs. Cada volume da fase orgânica deve conter lipídio ionizável correspondente ao RNAm em três volumes da fase aquosa.
