Este protocolo descreve a fabricação de micro hastes de gel que se interligam em andaimes de microporos. Esses andaimes podem ser utilizados em combinação com células, fornecendo o espaço necessário para uma interação celular eficiente. Os dois tipos diferentes de micro hastes de gel se interligam após o contato.
Na alta proporção leva a poros maiores, mantendo a estabilidade do andaime usando menos material sintético em comparação com microgéis esféricos. Os andaimes de microporos aumentariam significativamente a infiltração e a interação de células endógenas para reparar o tecido danificado. Os poros grandes facilitarão a formação de vasos sanguíneos para trocar nutrientes para o tecido em crescimento.
A redução do material em andaimes é benéfica à medida que mais espaços abertos são fornecidos para a formação de tecidos, o que é importante para aplicações in vitro e in vivo. Um aspecto crítico é a técnica microfítica na quipulação. Para garantir a produção contínua de micro hastes de gel, o produto deve ser efetivamente transportado para fora do tubo sem entupimento.
Para começar, insira as agulhas nos tubos de polietileno e remova o gás da seringa e do tubo. Em seguida, insira um tubo de polietileno adicional na saída para a coleta do produto. Em seguida, coloque todas as seringas de vidro e as bombas de seringa e insira cada extremidade da tubulação na entrada correspondente.
Em seguida, foque o microscópio na seção transversal da água do óleo. Inicie a primeira bomba de seringa de óleo para encher o canal com óleo primeiro, para evitar a umectação do canal pela fase dispersa. Em seguida, diminua a primeira taxa de fluxo de óleo para 30 microlitros por hora e inicie a bomba de seringa pré-polimérica até que a fase aquosa dispersa possa ser observada na seção transversal.
Em seguida, defina a taxa de fluxo pré-polímero para 30 microlitros por hora e foque o microscópio na saída. Em seguida, inicie a segunda bomba de seringa de óleo e aguarde até que o regime de fluxo esteja estável. Coloque o tubo de saída em um recipiente de coleta e ajuste o sistema de irradiação UV de modo que a irradiância esteja na faixa de 900 a 1000 miliwatts por centímetro ao quadrado.
E o ponto de irradiação é a parte do canal reto antes da saída. Antes da irradiação UV, ajuste as taxas de fluxo do pré-polímero e do primeiro óleo para atingir a proporção desejada na faixa de 3,0 a 4,5 e defina o tempo de irradiação da fase dispersa para aproximadamente 2,3 segundos, dependendo do tamanho do ponto de irradiação. Em seguida, inicie a irradiação UV e, se necessário, ajuste as taxas de fluxo novamente de acordo com a subseção anterior.
Em seguida, altere o contêiner de coleta e anote a hora de início e as taxas de fluxo da coleta do produto. Para encerrar a coleção, remova o contêiner de coleta anotando a hora. Depois, pare a irradiação e todas as bombas de seringa.
Subsequentemente, lave o produto cinco vezes cada com n-hexano, isopropanol e água deionizada. Em seguida, remova o sobrenadante após a sedimentação da haste. Transfira a primeira dispersão do componente para um frasco cônico transparente de 1,5 ou dois mililitros.
Em seguida, adicione o segundo componente de forma controlada em uma operação contínua com uma pipeta de 100 microlitros e misture o conteúdo diretamente usando a pipeta para absorver o líquido e adicioná-lo novamente. Em seguida, adicione a solução G R G D S P C à estrutura interligada para modificar todos os grupos epóxi restantes com o peptídeo adesivo celular contendo uma amina livre e tial e deixe à temperatura ambiente durante a noite. Em seguida, remova as moléculas não reagidas lavando com água deionizada e remova o sobrenadante.
Depois de reduzir o nível de água, abra o frasco para injetáveis e desirradie com luz UV de comprimento de onda, 250 a 300 nanómetros. Em seguida, feche o frasco para injetáveis e transfira-o para uma bancada limpa. Depois, lave com água estéril.
Substitua a água do frasco para injetáveis por meios de cultura celular e deixe o equilíbrio durante cinco minutos. Em seguida, transfira o andaime macroporoso para uma placa de poço de cultura celular para o experimento derramando ou usando uma espátula. A microscopia confocal revelou que o construto macroporoso 3D foi composto por bastonetes microgel funcionalizados com amina e epóxi interligados.
A construção exibe uma geometria compacta de aproximadamente 10.000 micro hastes de gel formadas dentro de dois ou três segundos. O módulo eficaz de Young de amina e epóxi micro gel hastes, juntamente com amina e epóxi micro gel esferas é medido por nano indentação. Para detectar grupos funcionais ativos, o tiocianato de isociana fluoresceína pode ser usado para visualizar grupos amino primários e o isômero de amina fluoresceína pode ser empregado para marcar grupos epóxi.
As hastes de microgel de amina têm dimensões com um comprimento médio de 553 micrômetros e uma largura média de 193 micrômetros em água deionizada, resultando em uma proporção de aproximadamente 3,0. Os valores médios dos macroporos e dos andaimes compostos por micro hastes de gel são de 100 micrômetros, com 90% dos tamanhos dos poros variando de 30 micrômetros a mais de 150 micrômetros. A esfera, como os microgéis, resulta em aglomerados com tamanhos de poros entre aproximadamente 10 a 55 micrômetros, com um valor médio de cerca de 22 micrômetros.
As hastes de micro gel descritas são projetadas para produzir andaimes de microporos interligados por mistura aleatória. Um procedimento de mistura controlado poderia permitir a fabricação de geometrias de andaimes mais personalizadas no futuro. A rigidez dos microgéis e as pistas bioquímicas podem ser variadas com base nos requisitos de vendas.
Ao combinar diferentes blocos de construção, uma grande variedade de geometrias e propriedades pode ser alcançada dentro de um andaime. Desta forma, podemos direcionar células específicas de forma eficiente para formar tecidos multicelulares.
