O protocolo apresentado é um método altamente flexível para manipulação do genoma no oviduto de camundongos. Permite a formação de células esporadicamente mutadas cercadas por células inéditas em ambiente imunocompetente. Isso é vantajoso para estudar a iniciação do câncer.
A principal vantagem desta técnica é a sua alta adaptabilidade em visar um órgão, área, região ou tipo de célula de interesse com conjuntos facilmente intercambiáveis de combinações de mutação, tudo sem a necessidade absoluta de uma linhagem de camundongo. Este método pode ser facilmente adaptado para uso em órgãos com o lúmen, bem como parênquima orgânico. Para começar, puxe um tubo capilar de vidro em um ponto afiado usando um puxador de micropipeta.
Usando um par de pinças cônicas de ponta ultrafina, corte a extremidade pontiaguda do tubo capilar puxado sob um microscópio dissecante para criar uma abertura. Certifique-se de que a abertura não é muito grande, pois danificará o oviduto e evitará a injeção lenta. Em seguida, disponha o equipamento de cirurgia estéril, microscópio, micromanipulador e eletroporator em uma bancada limpa e estéril ou dentro do gabinete de biossegurança.
Aqueça a almofada de aquecimento num disco e coloque-a debaixo de uma gaiola limpa e totalmente equipada. Despeje 1X PBS estéril em uma placa de Petri. Usando uma tesoura limpa, corte o papel absorvente em quadrados de um por um centímetro.
Solte-os no PBS para deixá-los de molho. Em seguida, prenda a agulha capilar puxada ao micromanipulador montado em grampo, estabilizado por um suporte magnético. Pipetar dois microlitros da solução injetável para uma placa de Petri estéril.
Ao observar ao microscópio, leve lentamente um a dois microlitros da solução de injeção para a agulha de microinjeção usando a seringa com pressão de ar conectada ao micromanipulador. Evite pegar bolhas na agulha. Depois de anestesiar uma rata de seis a oito semanas de idade e administrar carprofeno por via subcutânea, coloque o rato sobre o papel absorvente aquecido com o lado dorsal virado para cima.
Aplique lubrificante ocular em cada olho para evitar o ressecamento durante a cirurgia. Depois de confirmar a parada anestésica apertando o dedo do pé com um par de pinças, remova a pele dorsal ao redor do local da incisão prospectiva e limpe a pele nua com antisséptico. Use um par de pinças retas e rombas para beliscar a pele nua e criar uma incisão de um centímetro de comprimento ao longo da linha média do corpo usando uma tesoura estéril.
Aperte e segure um lado do local de corte usando um par de pinças Adson estéreis. Em seguida, com um par de pinças estéreis, curvas e serrilhadas, separe suavemente a pele da parede corporal, iniciando na incisão mediana e movendo-se lateralmente. Depois de localizar o coxim gorduroso abaixo do rim, use um par de pinças estéreis, retas e rombas para beliscar a parede do corpo diretamente acima do coxim de gordura.
Crie uma pequena incisão na parede do corpo usando um par de tesouras dissecantes estéreis, afiadas e pontiagudas, tomando cuidado para evitar vasos sanguíneos. Enquanto ainda belisca a parede do corpo com pinças retas e contundentes, insira um par de pinças estéreis, rombas e curvas na incisão e amplie a incisão criada na parede do corpo. Pegue o coxim de gordura visível com a pinça curva e contundente e puxe-o para fora do orifício para expor o ovário, o oviduto e o útero.
Mantenha a trilha reprodutiva exposta apertando a almofada de gordura com uma braçadeira de buldogue estéril. Coloque cuidadosamente o camundongo anestesiado com a via reprodutiva exposta no palco de um microscópio dissecante. Ajuste o micromanipulador de modo que a agulha de injeção com a solução seja observada ao microscópio.
Em seguida, manipule o microscópio para observar facilmente o ovário, o oviduto e o útero. Usando um par de pinças estéreis, cônicas e de ponta ultrafina, segure a região do oviduto a ser injetado. A região deve estar alinhada com a direção da agulha de microinjeção.
Ajuste o micromanipulador para puncionar o oviduto com a agulha de microinjeção, enquanto simultaneamente alimenta o oviduto na agulha usando a pinça cônica de ponta ultrafina. Mova suavemente a agulha de microinjeção para confirmar que foi inserida no oviduto. Injetar lentamente um microlitro da solução injetável e azul de tripano filtrado a 5% no oviduto, observando o movimento da solução azul e a expansão do lúmen do oviduto.
Evite introduzir bolhas no lúmen. Após a injeção, remova a agulha do oviduto e cubra a área a ser atingida com um pedaço de papel absorvente pré-embebido em PBS. Segure o papel pré-embebido e a área a ser atingida com uma pinça de eletrodos e afaste-se do corpo.
Eletroporar a região alvo usando três pulsos unipolares a 30 volts por 50 milissegundos com intervalos de um segundo. Após a eletroporação, remova o papel absorvente e coloque o mouse de volta na almofada de aquecimento. Desaperte a braçadeira do buldogue e empurre cuidadosamente a trilha reprodutiva exposta de volta sob a parede do corpo.
Depois que ambos os ovidutos tiverem sido eletroporados e colocados de volta sob a parede do corpo, use um suporte de agulha para agarrar a agulha. Aperte e segure um lado do local do corte usando um par de pinças estéreis, curvas e serrilhadas. Em seguida, use o porta-agulhas para manipular a sutura e fechar a ferida.
Mova o mouse para uma gaiola limpa colocada em cima de uma almofada de aquecimento e monitore até que o mouse esteja ativo. À eletroporação com eletrodos do tipo tweezer de três ou um milímetro, a área alvo marcada com TdTomato foi restrita ao epitélio distal do oviduto. Com eletrodos do tipo tweezer de três milímetros, uma área muito maior das ampolas foi direcionada em comparação com o alvo apenas da ponta mais distal, o infundíbulo, usando eletrodos do tipo tweezer de um milímetro.
Na região alvo, células eletroporadas marcadas por TdTomato foram distribuídas aleatoriamente entre células não eletroporadas. Além disso, as células eletroporadas estavam restritas ao epitélio da mucosa e não foram observadas no estroma ou na camada muscular subjacente. Para confirmar a edição do genoma mediada por CRISPR, células fluorescentes podem ser isoladas por classificação FACS para isolamento e sequenciamento de DNA.
Isso nos permite quantificar a frequência de alelos-alvo, rastrear as comunicações únicas entre as amostras para acompanhar a evolução coronal in vivo do tumor primário e da metástase em ambiente imunocompetente.
