Em 1988, Richard Lenski iniciou um experimento de evolução. Ele preencheu 12 frascos de Erlenmeyer com um meio de crescimento definido limitado à glicose, conhecido como DM25. Ele inoculou seis desses frascos com uma cepa de E.coli conhecida como REL606, que é incapaz de utilizar a arabinose de açúcar como nutriente.
Essas populações foram designadas de A-1 a A-6. Ele inoculou os outros seis com uma cepa quase idêntica conhecida como REL607, que é capaz de utilizar arabinose. Essas cepas ancestrais, as E.coli que evoluíram a partir delas, podem ser distinguidas quando plaqueadas em ágar tetrazólio ou arabinose.
As estirpes Ara+formam colónias vermelhas, e as estirpes Ara+formam colónias brancas. Lenski colocou esses frascos em uma incubadora de agitação a 37 graus Celsius, permitindo que eles crescessem até a saturação e esgotassem a glicose no meio. Neste ponto, ele transferiu 1% da cultura de cada um dos frascos para um novo conjunto de 12 frascos contendo meio fresco.
Esses ciclos diários de transferência e recrescimento foram continuados por décadas, criando uma longa história de evolução que pode ser estudada pelos pesquisadores. Em nosso protocolo, descrevemos como as populações do experimento de evolução de longo prazo, ou LTEE, são transferidas e cultivadas a cada dia. Em seguida, descrevemos como as populações são regularmente verificadas quanto a possíveis sinais de contaminação e arquivadas para fornecer um registro permanente congelado para estudos posteriores.
Costumamos nos referir a isso como o registro fóssil do LTEE. Uma maneira importante de monitorar o ritmo geral e o caráter das mudanças evolutivas no LTEE é através da medição da aptidão relativa das populações e cepas do experimento. Descrevemos como conduzir esses ensaios de competição de cocultura e analisamos os dados resultantes para calcular os valores de aptidão relativa.
Vamos mostrar o primeiro e o último desses procedimentos neste vídeo. Primeiro, demonstraremos uma transferência diária do experimento de evolução de longo prazo. Desinfete a superfície na qual as transferências de LTEE serão conduzidas, limpando-a com etanol a 70% ou uma solução de água sanitária a 10%.
Acenda um queimador de Bunsen para criar uma corrente ascendente local e permitir a queima de vidraria. Preparar 13 frascos Pyrex Erlenmeyer de 50 mililitros tampados com Pyrex de 20 mililitros ou copos de polipropileno que tenham sido lavados e esterilizados por autoclavagem. Verifique se há detritos visíveis nos frascos e substitua os que não estiverem perfeitamente limpos.
Rotular seis frascos A-1 a A-6 usando um marcador vermelho e os outros seis frascos A+1 a A+6 usando um marcador preto. Rotular o último frasco restante, que será o branco, com a data, em formato mês-dia, e o dia da semana. Encher cada um dos 13 frascos com 9,9 mililitros de meio DM25 usando uma pipeta sorológica estéril de 10 mililitros.
Inflamar a boca de cada frasco depois de retirar o copo que serve de tampa e antes de substituir o copo. Chame a ponta da pipeta entre o enchimento de cada frasco. Retire os frascos LTEE do dia anterior da incubadora de agitação.
Examine cada um por sua vez, segurando-o até a luz para avaliar sua turbidez e cor. Verifique a integridade do frasco e procure a presença de material estranho. Usando um micropipetor P200 com uma ponta de filtro estéril, transfira 100 microlitros de cultura de cada frasco LTEE para o frasco correspondente contendo DM25 fresco.
Comece com A-1 e, em seguida, transfira A+1. Depois disso, continue alternando entre as populações menos e mais. Para acompanhar quais culturas foram transferidas, desloque os frascos para a esquerda como pipetagem de ou para eles.
Observe técnica asséptica rigorosa durante as transferências. Use uma ponta de pipeta fresca para cada transferência. Inflamar as bocas dos frascos imediatamente após o desencape e antes de reencapar e limpar o barril e o injetor do micropipettor com um Kimwipe umedecido com etanol 70% entre cada transferência.
Incubar os frascos recém-inoculados a 37 graus Celsius durante 24 horas com 120 rotações por minuto a tremer orbital ao longo de uma polegada de diâmetro. Guarde as culturas do dia anterior a quatro graus Celsius. Retenha essas culturas por dois dias.
Descarte culturas mais antigas que foram salvas a quatro graus Celsius três dias antes neste momento. Insira a hora, data, número de transferência, seu nome ou iniciais, se as culturas estavam ou não corretas e qualquer outra informação relevante no caderno de registro de transferência. Outras 6 2/3 gerações se passaram na história do experimento de evolução de longo prazo com E.coli.
Se houver algum problema, acidente ou suspeita de contaminação com as culturas LTEE do dia anterior, não transfira delas. Em vez disso, armazene todo o conjunto de 12 culturas a quatro graus Celsius para exame posterior e caracterização adicional. Recupere os frascos de reserva que foram transferidos do dia anterior e armazenados a quatro graus Celsius.
Coloque-os na bancada para aquecer até à temperatura ambiente. Agitar suavemente cada frasco para ressuspender as células. Transferir de cada balão para meio fresco num novo conjunto de frascos e continuar a experiência normalmente.
Anote no log de transferência que você usou as culturas de backup e registre o mesmo número de transferência do dia anterior. Se a contaminação for observada nos frascos de reserva armazenados a quatro graus Celsius, as populações LTEE afetadas devem ser reiniciadas a partir de estoques congelados. Em seguida, demonstraremos um ensaio de competição de co-cultura que pode ser usado para medir a aptidão relativa de duas cepas ou populações do experimento de evolução de longo prazo.
Mostraremos um experimento de competição que evolui ambos os ancestrais LTEE, REL606 e 607, e duas populações evoluídas, a população A-5 em 20.000 gerações, REL8597;e a população A+5 em 20.000 gerações, REL8604. Esses ensaios usaram replicação de seis vezes para cada par de um competidor Ara-e Ara+. Decida quantas cepas e/ou populações LTEE concorrentes você usará e quantos ensaios de competição de replicação serão realizados para cada par de competidores.
Prepare os suprimentos necessários da seguinte maneira. Para o dia de renascimento, dia menos dois, encha um frasco Erlenmeyer estéril de 50 mililitros tampado com um copo de 20 mililitros com 9,9 mililitros de DM1000 ou caldo de lisogenia, LB, por cepa ou população de E.coli que será usada como concorrente. Encher mais um frasco com 9,9 mililitros do mesmo meio para servir como um branco não inoculado.
Para o dia de pré-condicionamento, dia menos um, encha um tubo de ensaio com 9,9 mililitros de soro fisiológico estéril 0,85% por volume por competidor, dois frascos com 9,9 mililitros de DM25 por ensaio de repetição entre um par de competidores e mais um frasco com 9,9 mililitros de DM25 para um branco. Para o dia de início da competição, dia zero, encher um frasco com 9,9 mililitros de DM25, encher um tubo de ensaio com 9,9 mililitros de soro fisiológico estéril e preparar um tetrazólio ou arabinose, ou placa TA, por repetição de ensaio de competição. Encha mais um frasco com 9,9 mililitros de DM25 para servir em branco.
Se você estiver realizando uma competição de três dias, preencha dois conjuntos adicionais de frascos de competição. Para o último dia de competição, encha dois tubos de ensaio com 9,9 mililitros de soro fisiológico estéril e prepare uma placa TA por réplica de competição. No dia menos dois de um experimento de competição, você revive os competidores separadamente dos estoques de freezer.
Tire os criósculos contendo os estoques congelados das cepas concorrentes do freezer de 80 graus Celsius. Mantenha os frascos refrigerados em um balde agradável enquanto os usa. Depois que cada estoque congelado descongelar, vomite-o completamente para ressuspender as células de E.coli.
Se reviver um clone, inocular o frasco contendo meio fresco com 12 microlitros do caldo congelado. Se reviver uma população, inocular com 120 microlitros do estoque congelado. Incube os frascos de reavivamento no branco a 37 graus Celsius durante a noite com 120 rotações por minuto agitando orbital sobre uma polegada de diâmetro.
No dia menos um de um experimento de competição, você pré-condiciona os competidores separadamente no DM25. Retire da incubadora os frascos contendo as culturas dos competidores revividos. Transfira 100 microlitros de cada frasco para o tubo de ensaio de soro fisiológico para aquele competidor.
Vórtice completamente cada tubo de diluição antes de transferir 100 microlitros da cultura diluída para um frasco com DM25 fresco. Inocular dois desses frascos de pré-condicionamento para cada ensaio de réplica, um para cada um dos competidores. Incubar os frascos de pré-condicionamento no branco a 37 graus Celsius durante 24 horas.
No dia zero de um experimento de competição, você começa a competição misturando os competidores e a placa para as contagens iniciais. Retire os frascos de pré-condicionamento da incubadora. Transfira 50 microlitros do concorrente Ara-para o primeiro frasco de competição de réplica preenchido com DM25 fresco.
Transfira imediatamente 50 microlitros do concorrente Ara+ para o mesmo frasco de competição. Misture o balão girando suavemente. Repita essas etapas para combinar todas as réplicas de todos os pares de concorrentes que você estava testando.
Transferir 100 microlitros de cada frasco de competição recém-inoculado para o tubo de ensaio de solução salina marcada para a replicação do ensaio de competição. Coloque os novos frascos de competição e em branco na incubadora de agitação. Enquanto isso, no mesmo dia, vórtice cada tubo de ensaio completamente e placa 80 microlitros dessas diluições de 10.000 vezes em placas TA.
Rotule o lado do fundo de cada placa com o par de cepas que foram misturadas, o número da réplica e o dia zero para indicar que será usado para determinar a representação inicial de cada competidor. Incube as placas TA de cabeça para baixo em uma incubadora de convecção gravitacional a 37 graus Celsius até que as colônias dos competidores Ara-e Ara+, sejam visíveis e distinguíveis. Geralmente, isso ocorre dentro de 16 a 24 horas, mas pode levar mais tempo para algumas cepas evoluídas.
Conte os números de colônias Ara-vermelhas e Ara+brancas em cada placa e registre os resultados. Se você estiver realizando uma competição de três dias, transfira 100 microlitros de cada competição para 9,9 mililitros de meio DM25 fresco em um novo frasco após o crescimento. Incubar estes frascos durante 24 horas.
Realizar outra transferência da mesma forma e incubar os frascos de dois dias por 24 horas para completar três ciclos completos de crescimento de co-cultura dos competidores sob condições LTEE. No último dia da competição, dia um ou dia três, dependendo da duração do seu experimento, você vai chapar para as contagens finais. Tire os frascos de competição da incubadora.
Transfira 100 microlitros de cada frasco de competição para o primeiro tubo de ensaio de soro fisiológico para essa replicação. Vórtice cada tubo de diluição de 100 vezes para misturá-lo completamente e transferir 100 microlitros para o segundo tubo de soro fisiológico para essa replicação. Os tubos resultantes contêm diluições de 10.000 vezes das culturas de DM25.
Vórtice cada tubo de ensaio contendo uma diluição de 10.000 vezes completamente e placa 80 microlitros dele em uma placa TA. Rotule o lado do fundo de cada placa com o par de cepas que foram misturadas, o número de réplica e o primeiro dia para uma competição de um dia ou o terceiro dia para uma competição de três dias para indicar que ele será usado para determinar a representação final de cada competidor. Incubar as placas TA a 37 graus Celsius e contar as colônias Ara-e Ara++, após o crescimento.
Use a planilha Excel fornecida com este protocolo, ou o pacote Fitness RR, para calcular a aptidão relativa das tensões em sua competição e plotar os resultados. Durante as transferências diárias do experimento de evolução de longo prazo, a densidade das culturas após o crescimento é muito baixa e muitas vezes deve ser julgada segurando uma cultura ao lado de um branco. A exceção é a população A-3 que evoluiu para usar citrato no meio como fonte adicional de nutrientes e cresce até cerca de dez vezes a densidade celular das outras populações.
Medidas da densidade óptica nas culturas LTEE também podem ser usadas para monitorar o crescimento esperado. Para os ensaios de competição de exemplo, esperamos que um competidor mais apto aumente sua representação ao longo do tempo, em relação a um concorrente menos apto. Examinando as placas TA com colônias cultivadas a partir de diluições de apenas uma réplica da competição entre as duas cepas ancestrais mostra que a proporção permanece relativamente constante ao longo de um experimento de competição de três dias.
Em contraste, a população A+5 supera rapidamente o ancestral REL606. E a população A-5 supera rapidamente o ancestral REL607. As duas populações evoluídas são quase iguais.
As representações das colônias vermelhas e brancas permanecem quase as mesmas ao longo dos três dias de competição. Usando as contagens de colônias após um dia de co-cultivo, descobrimos que as aptidões das populações evoluídas aumentaram em 60% durante o LTEE em relação às cepas ancestrais de E.coli. Ao continuar a transferir as competições ao longo de vários dias, podemos melhorar a precisão das medições de aptidão relativa para os competidores que são estreitamente combinados.
Mas quando dois competidores têm aptidões muito diferentes, não há mais uma representação adequada de ambas as colônias após uma competição de vários dias para calcular a aptidão relativa. Os métodos que demonstramos aqui são críticos para estudar o registro histórico único do LTEE e para continuar este experimento de evolução aberto. Eles também podem fornecer um ponto de partida para outros que estão considerando novos experimentos de evolução que abordam novas questões, usam novos ambientes e estudam diferentes microrganismos.
