Agradecemos o apoio da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 31800903, concedido a W. Zheng) e do Wenzhou Science and Technology Project (No. Y2020426, concedido a Y. Y. Weng) por este trabalho.

Todos os procedimentos em animais descritos neste estudo foram conduzidos de acordo com as diretrizes descritas no Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Wenzhou.
1. Animais
<ol><li>Compre camundongos C57BL/6 machos com idade entre 8-12 semanas e pesando 20-22 g.</li>
	<li>Obter a linhagem transgênica Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) e camundongos machos A2ARflox/fox .</li>
	<li>Atribua aleatoriamente os camundongos a dois grupos e aloja-se em gaiolas, com um máximo de cinco camundongos por gaiola, sob um ciclo padrão de 12 h claro/12 h escuro por 1 semana.</li>
	<li>Fornecer aos ratos comida e água suficientes e mantê-los a uma temperatura constante a 25 °C.</li>
</ol>2. Knockdown específico de ChP de A2ARs com AAV2/5-shRNA
<ol><li>Pese cada mouse e anote os valores.</li>
	<li>Anestesiar os camundongos por via intraperitoneal com pentobarbital sódico a 1% na dose de 6-8 mL/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital e colocar o mouse em uma almofada de aquecimento para mantê-lo aquecido. NOTA: É crucial administrar a dosagem correta de pentobarbital sódico de acordo com o peso do rato para garantir o sucesso da cirurgia. A anestesia não deve ser muito profunda, pois pode resultar em mortalidade, mas não deve ser muito superficial, pois o camundongo pode acordar durante o procedimento, potencialmente afetando a eficácia da injeção do vírus. Verifique a dose adequada de anestesia por pinça dos dedos dos pés e certifique-se de que os ratos não respondem.</li>
	<li>Use um barbeador de rato especializado para aparar o cabelo superior dos ratos anestesiados.</li>
	<li>Aplique pomada ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento e fixe os ratos em um aparelho estereotáxico para imobilizar o cérebro. Cubra o animal com um campo estéril.</li>
	<li>Esterilize completamente a pele da cabeça e pescoço dos ratos com três rodadas de desinfetante iodóforo e álcool a 75% para reduzir a infecção pós-operatória. Em seguida, aplique lidocaína a 1% topicamente no couro cabeludo de camundongos e faça uma pequena incisão para expor totalmente o crânio sob um microscópio. OBS: Utilizar instrumentos estéreis durante todo o procedimento.</li>
	<li>Preparar duas seringas de 10 μL: uma com AAV2/5-A 2A R-shRNA comprado (título: 6,27 × 109 vg/μL) e outra com AAV2/5-Scramble comprado (título:6,21× 109 vg/μL). NOTA: Ao usar a seringa, a extremidade frontal precisa ser conectada a um capilar de vidro, e uma faixa de 10 μL pode ser obtida controlando o comprimento do capilar de vidro.</li>
	<li>Utilizar o microscópio para localizar o bregma e lambda e definir o ponto de coordenadas (AP: -0,58; LM: ±1,10; DL: -2,20) na seringa de 10 μL (Figura 1). O ponto coordenado é baseado no atlas estereotáxico cerebral de camundongos15.</li>
	<li>Faça um pequeno orifício no crânio no ponto de coordenada ajustado. NOTA: Sob o microscópio, a perfuração é realizada usando uma microbroca estéril contra a superfície do crânio. Após a perfuração, removendo as meninges que cobrem o cérebro e expondo o parênquima cerebral subjacente, a lesão nos vasos sanguíneos é evitada. Essa etapa evita que a ponta do capilar de vidro seja quebrada pelas meninges. O diâmetro do orifício perfurado deve ser suficiente para permitir que a ponta da agulha entre no tecido cerebral.</li>
	<li>Administrar 2 μL do vírus AAV2/5-A2AR-shRNA no ventrículo cerebral através de injeção lateral a uma taxa constante de 100 nL/min. Mantenha a agulha no lugar por 10 minutos antes de retirar. Note-se que o vírus foi administrado com injeção unilateral.</li>
	<li>Sele a pele lesionada usando cola de biofibrina médica imediatamente para evitar a perda de vírus, que pode ser enxaguado com LCR depois de remover a agulha se a cola não for aplicada rapidamente. Além disso, não use cotonetes para limpar o LCR, pois também pode causar perda de vírus.</li>
	<li>Para facilitar a recuperação, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal em 37,0 ± 0,5 °C e aplique lidocaína a 1% topicamente no couro cabeludo do mouse. Permitir que os camundongos se recuperem por 2 semanas antes de induzir o modelo EAE, pois esse período é necessário para a expressão do vírus AAV2/5-A2AR-shRNA e subsequente knockdown A2AR.</li>
</ol>3. Knockdown específico de ChP de A2AR com um Cre/locus do sistema X-overP1 (Cre/LoxP)
Observação : os procedimentos a seguir podem ser obtidos usando o método descrito anteriormente. Consulte os passos 2.1-2.11 para obter métodos de injeção detalhados.
<ol><li>Injetar 2 μL de CRE-TAT recombinase em cada ventrículo lateral de um camundongo Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato como grupo experimental e 2 μL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) como grupo controle. Usando o mesmo protocolo acima (seção 2), injete 2 μL de CRE-TAT recombinase em cada um dos ventrículos laterais de camundongos A2AR flox/flox juntamente com 2 μL de PBS estéril como grupo controle.</li>
	<li>Preparar cortes de tecido congelado e realizar coloração nuclear 2 semanas após a injeção de CRE-TAT recombinase. Consulte as etapas 4.1-4.3 para obter mais informações.</li>
</ol>4. Perfusão transcárdica em camundongos
<ol><li>Administrar 60-80 mg/kg de pentobarbital sódico para anestesiar profundamente os camundongos. Confirmar o plano de anestesia por uma pinça dos dedos dos pés e realizar a perfusão transcárdica usando 40 mL de solução estéril de PBS seguida de 20 mL de paraformaldeído (PFA) a 4%. NOTA: A perfusão bem-sucedida é indicada por uma cor branca no fígado, enquanto a presença de pulmões aumentados ou saída de PBS da boca durante a perfusão sugere uma falha do procedimento.</li>
	<li>Extraia rapidamente o cérebro do rato, garantindo uma degradação mínima das proteínas.</li>
	<li>Submergir o cérebro de camundongos em PFA/PBS a 4% durante a noite para pós-fixação, seguido de substituição por solução de sacarose PB a 30% por 72 h. NOTA: É fundamental evitar a desidratação excessiva do tecido cerebral, por isso o cérebro não deve ser deixado na solução de sacarose PB por muito tempo.</li>
</ol>5. Corte e coloração de tecidos congelados
<ol><li>Incorpore o cérebro de camundongo previamente desidratado em cola de temperatura de corte ideal (OCT), congele o cérebro embutido e use um micrótomo deslizante para cortar seções coronais com uma espessura de 20 μm.</li>
	<li>Coloque as seções cerebrais na lâmina de vidro. Quando as seções cerebrais estiverem secas, armazene-as em uma geladeira de -20 °C para experimentos subsequentes.</li>
	<li>Coloque cada lâmina de vidro em uma caixa de moldura e submerja a moldura em um recipiente cheio de PBS para enxaguar completamente a lâmina. Enxaguar suavemente as lâminas cerebrais com solução de PBS três vezes, por 10 min cada vez. NOTA: Deve-se ter cuidado para evitar que as seções cerebrais caiam da lâmina de vidro.</li>
	<li>Manchar as lâminas cerebrais com solução de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 10 min.</li>
	<li>Enxaguar as lâminas cerebrais com solução PBS por 5 min.</li>
	<li>Aplique uma gota de meio de montagem antifade nas seções cerebrais.</li>
	<li>Coloque uma lamínula nas seções cerebrais, sele a lamínula com esmalte e analise as seções usando um microscópio de fluorescência convencional.</li>
</ol>6. Indução do EAE
NOTA: Realizar indução de EAE após 2 semanas da injeção de shRNA ou CRE-TAT recombinase11.
<ol><li>Criar uma solução aquosa misturando 2,5 mg de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG35-55) com 2 mL de PBS. Preparar uma solução completa de óleo de adjuvante de Freunds (CFA) misturando M. tuberculosis (H37Ra) com adjuvante de Freunds incompleto (IFA).</li>
	<li>Misture as soluções aquosas e oleosas na proporção de 1:1. Use um tubo de tee para bater a mistura em um estado de óleo em água. NOTA: O tee pipe também é chamado de tubo de três vias. É um tubo de plástico que pode controlar a direção da solução de fluxo para misturar totalmente o MOG35-55 e CFA.</li>
	<li>Use um homogeneizador de alta velocidade para fazer a emulsão de antígeno MOG para o modelo EAE em condições de banho de gelo.</li>
	<li>Anestesiar os camundongos por via intraperitoneal com pentobarbital sódico a 1% na dose de 6-8 mL/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital.</li>
	<li>Injetar subcutaneamente a emulsão do antígeno MOG em quatro pontos diferentes (pescoço, costas, quadris esquerdo e direito) a um volume de 10 mL/kg para um total de quatro injeções cada. NOTA: É importante selecionar cuidadosamente o local de injeção, pois diferentes locais podem ter efeitos variados na morbidade e mortalidade de camundongos. Além disso, injeções repetidas de MOG podem levar à tolerância imunológica, então a equipe de pesquisa escolheu um único método de injeção para evitar esse problema potencial.</li>
	<li>Injetar imediatamente 500 ng/mL de toxina pertussis (TP) por via intraperitoneal na dose de 5 mg/kg após a injeção de MOG. NOTA: O PT aumenta a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE) e facilita a infiltração de células T no cérebro.</li>
	<li>Após 48 h, injetar intraperitonealmente a solução de TP no mesmo volume.</li>
</ol>7. Escore de déficit neurológico
<ol><li>Avaliar e classificar os camundongos diariamente usando uma escala de classificação16 que varia de 0 a 15 para avaliar a incidência e gravidade do EAE de acordo com os seguintes déficits neurológicos: Cauda: 0 indica nenhum sinal, 1 representa uma cauda semiparalisada e 2 indica uma cauda totalmente paralisada. Membros: 0 indica nenhum sinal, 1 representa uma marcha fraca ou alterada, 2 indica paresia e 3 representa um membro totalmente paralisado.</li>
	<li>Atribua a um animal tetraplégico com paralisia completa uma pontuação de 12 e atribua à mortalidade uma pontuação de 15.</li>
</ol>8. Coloração hematoxilina-eosina (H&E)
<ol><li>Pegue o cérebro de camundongo desidratado e embuta-o em parafina derretida. Deixe o bloco de parafina esfriar e solidificar para uso posterior. NOTA: O bloco de parafina deve estar completamente seco e fresco para evitar danos teciduais.</li>
	<li>Corte o bloco de parafina cerebral de camundongo em lâminas de 5 μm de espessura. Coloque a secção do cérebro do rato em parafina numa lâmina de vidro e seque-a num forno a 60 °C durante 3 horas.</li>
	<li>Submergir as lâminas sequencialmente em solução de xileno I por 10 min, solução de xileno II por 10 min, álcool 100% I por 3 min, álcool 100% II por 3 min, álcool 95% por 3 min, álcool 90% por 3 min, álcool 80% por 3 min, álcool 70% por 3 min e água destilada por 1 min.</li>
</ol>9. Análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase (qPCR)
<ol><li>Depois de perfundir os camundongos com PBS, remova a ChP dos ventrículos e extraia o RNA com Trizol. Sintetizar o cDNA usando o primeiro Strand cDNA Synthesis Kit.</li>
	<li>Realize análise de qPCR usando pré-mistura verde Ex Taq SYBR e um sistema de PCR em tempo real. Use os seguintes primers A2AR: forward - GCCATCCCATTCGCCATCA; reverso - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.</li>
</ol>

Silenciamento seletivo de genes no plexo coróide

<ol>
	<li>Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+secretion+by+the+choroid+plexus.">Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus.</a> Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).</li><li>Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. 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Os autores afirmam que não têm interesses financeiros concorrentes ou outras divulgações a declarar.

A pesquisa apresentou duas abordagens distintas para o knockdown direcionado de genes ChP. A primeira abordagem envolveu a injeção ICV de CRE-TAT, que contém Cre recombinase, em camundongos A2AR flox/flox. A segunda abordagem envolveu a injeção de ICV de AAV2/5 carregando shRNA de A2AR. Utilizando essas duas estratégias, o trabalho conseguiu o knockdown seletivo de A 2A R dentro da ChP e foi capaz de demonstrar os efeitos protetores da inibição da sinalização A2AR na ...

Acreditava-se que o plexo coroide (PCc) ajudava a manter a homeostase funcional do cérebro por meio da secreção de líquido cefalorraquidiano (LCR) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)1,2. Pesquisas crescentes nas últimas três décadas têm revelado que a ChP representa uma via distinta para a infiltração de células imunes no sistema nervoso central (SNC).
As tight junctions (TJs) da ChP, compostas por um epitélio de ChP monocamada, mantêm a homeostase imunológica, impedindo a entrada de macromoléculas e células imunes no cérebro3. No entanto, sob certas condições patológicas, o tecido ChP detecta e responde a padrões moleculares associados ao perigo (DAMPs) no LCR e no sangue, levando a infiltração imunológica anormal e disfunção cerebral 4,5. Apesar de seu papel crítico, o pequeno tamanho da ChP e a localização única no cérebro dificultam o estudo de sua função sem afetar outras regiões cerebrais. Portanto, manipular a expressão gênica especificamente na ChP é uma abordagem ideal para entender sua função.
Inicialmente, linhagens transgênicas da enzima de recombinação de ciclização (Cre), que expressam Cre sob o controle de promotores específicos de genes expressos na ChP, foram comumente utilizadas para deletar genes-alvo por meio de cruzamento com genes candidatos floxados 6,7,8. Por exemplo, o fator de transcrição Forkhead box J1 (FoxJ1) é expresso exclusivamente no epitélio ChP do cérebro pré-natal de camundongos7. Assim, a linhagem FoxJ1-Cre foi frequentemente utilizada para deletar genes localizados na ChP 6,9. No entanto, o sucesso desta estratégia depende muito da especificidade do promotor. Descobriu-se gradualmente que o padrão de expressão de FoxJ1 não era suficientemente distinto, pois FoxJ1 também estava presente em células epiteliais ciliadas em outras partes do cérebro e sistema periférico7. Para superar essa limitação, foi realizada injeção intracerebroventricular (ICV) de Cre recombinase para liberar a recombinase nos ventrículos das linhas transgênicas floxed. Essa estratégia apresentou alta especificidade, evidenciada pela presença de fluorescência do tdTomato apenas no tecido daChP10,11. No entanto, este método ainda é limitado pela disponibilidade de linhagens de camundongos transgênicos floxed. Para resolver essa questão, pesquisadores têm empregado a injeção de ICV de vírus adenoassociado (AAV) para alcançar knockdown específico de ChP ou a superexpressão de genes-alvo12,13. Uma avaliação abrangente de diferentes sorotipos de AAV para infecção por ChP revelou que AAV2/5 e AAV2/8 exibem fortes habilidades de infecção na ChP, enquanto não infectam outras regiões cerebrais. No entanto, AAV2/8 infectou o ependima ao redor dos ventrículos, enquanto o grupo AAV2/5 não apresentou infecção14. Este método tem a vantagem de superar as limitações da aquisição de animais transgênicos floxed.
Este artigo descreve um protocolo passo-a-passo para knockdown gênico na ChP usando dois métodos: ICV de AAV2/5 carregando shRNA do receptor de adenosina A 2A (A 2A R) e proteína Cre recombinase consistindo de sequência TAT (CRE-TAT) recombinase para alcançar knockdown ChP-específico de A2A R. Os resultados do estudo sugerem que derrubar A2AR na ChP pode aliviar a encefalomielite autoimune experimental (EAE). Este protocolo detalhado fornece orientação útil para estudos da função ChP e knockdown específico de genes na ChP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2ARflox/flox mice</td>
			<td>State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2/5-A2AR-ShRNA virus</td>
			<td>Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD</td>
			<td>pt-4828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antifade mounting medium</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate glass capillary</td>
			<td>Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd</td>
			<td>B100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>brain stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD, Shenzhen</td>
			<td>69100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRE-TAT recombinase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Absin</td>
			<td>B25A031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>frozen slicing machine</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H37Ra</td>
			<td>Becton Dickinson and company</td>
			<td>231141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton, American</td>
			<td>P/N:&#160;86259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freunds adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35-55</td>
			<td>Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>4010006243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT glue</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>6502p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pentobarbital sodium</td>
			<td>Boyun Biotech</td>
			<td>PC13003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette gun</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N45014F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>&#160;6110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real- Time PCR System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>CFX96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A502792-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>super high speed homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene solution</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Reagent Company</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted knockdown of genes in the choroid plexus

O plexo coroide (PCh) serve como uma porta de entrada crítica para a infiltração de células imunes no sistema nervoso central (SNC) em condições fisiológicas e patológicas. Pesquisas recentes mostraram que regular a atividade da ChP pode oferecer proteção contra distúrbios do SNC. No entanto, estudar a função biológica da ChP sem afetar outras regiões cerebrais é um desafio devido à sua estrutura delicada. Este estudo apresenta um novo método para knockdown gênico em tecido ChP usando vírus adenoassociados (AAVs) ou enzima de recombinação de ciclização (Cre) proteína recombinase consistindo de sequência TAT (CRE-TAT). Os resultados demonstram que, após a injeção de AAV ou CRE-TAT no ventrículo lateral, a fluorescência foi concentrada exclusivamente na ChP. Usando esta abordagem, o estudo derrubou com sucesso o receptor de adenosina A 2A (A2A R) na ChP usando RNA de interferência (RNAi) ou Cre/locus de sistemas X-overP1 (Cre/LoxP), e mostrou que esse knockdown poderia aliviar a patologia da encefalomielite autoimune experimental (EAE). Essa técnica pode ter implicações importantes para pesquisas futuras sobre o papel da ChP nos distúrbios do SNC.

The choroid plexus (ChP) was often thought to help maintain brain functional homeostasis by secreting cerebrospinal fluid (CSF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF)1,2. Increasing research over the last three decades has revealed that the ChP represents a distinct pathway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS).
The tight junctions (TJs) of the ChP, composed of a monolayer ChP epithelium, maintain immunological homeostasis by preventing macromolecules and immune cells from entering the brain3. However, under certain pathological conditions, the ChP tissue detects and responds to danger-associated molecular patterns (DAMPs) in the CSF and blood, leading to abnormal immune infiltration and brain dysfunction4,5. Despite its critical role, the ChP&#39;s small size and unique location in the brain make it difficult to study its function without affecting other brain regions. Therefore, manipulating gene expression specifically in the ChP is an ideal approach to understanding its function.
Initially, cyclization recombination enzyme (Cre) transgenic lines, which express Cre under the control of promoters specific to genes expressed in the ChP, were commonly used to delete target genes by breeding with floxed candidate genes6,7,8. For example, the transcription factor Forkhead box J1 (FoxJ1) is exclusively expressed in the ChP epithelium of the prenatal mouse brain7. Thus, the FoxJ1-Cre line was often used to delete genes located in the ChP6,9. However, the success of this strategy relies heavily on the specificity of the promoter. It was gradually discovered that the FoxJ1 expression pattern was not distinctive enough, as FoxJ1 was also present in ciliated epithelial cells in other parts of the brain and peripheral system7. To overcome this limitation, intra-cerebroventricular (ICV) injection of Cre recombinase was performed to deliver recombinase into the ventricles of floxed transgenic lines. This strategy showed high specificity, as evidenced by the presence of tdTomato fluorescence solely in the ChP tissue10,11. However, this method is still limited by the availability of floxed transgenic mouse lines. To address this issue, researchers have employed ICV injection of adeno-associated virus (AAV) to achieve ChP-specific knockdown or the overexpression of target genes12,13. A comprehensive evaluation of different AAV serotypes for ChP infection revealed that AAV2/5 and AAV2/8 exhibit strong infection abilities in the ChP, while not infecting other brain regions. However, AAV2/8 was found to infect the ependyma surrounding ventricles, whereas the AAV2/5 group showed no infection14. This method has the advantage of overcoming the limitations of acquiring floxed transgenic animals.
This article describes a step-by-step protocol for gene knockdown in the ChP using two methods: ICV of AAV2/5 carrying shRNA of the adenosine A2A receptor (A2AR) and Cre recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT) recombinase to achieve ChP-specific knockdown of A2AR. The study findings suggest that knocking down A2AR in the ChP can alleviate experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This detailed protocol provides useful guidance for ChP function studies and the specific knockdown of genes in the ChP.

Autor em destaque: Insights e inovações em técnicas de manipulação de expressão gênica para pesquisa do plexo coróide 

Knockdown direcionado de genes no plexo coroide

The objective of this research is to investigate the techniques for manipulating gene expression in the choroid plexus. Our study has introduced the two methods that allow for technique exclusively in the choroid plexus without any discernible impact on other regions. Our findings can potentially enhance future function studies of the choroid plexus in neuroscience.Our research has reviewed that inhibiting T-cell infiltration across the choroid plexus through selective lockdown of adenosine to a receptor is sufficient to protect mice from EAE pathology. This finding supports the notion that detecting gateway activity in the choroid plexus could present a promising new strategy for treating multiple sclerosis. This study presents two alternative methods for gene expression manipulation in the choroid plexus.ICV injection of Cre recombinase into those transgenic mice or ICV injection of AAV2/5, or it's targeted SHI in the WT mice. These methods overcome issues with promoting specificity and transgenetic mouse breeding.

knockdown de A2AR específico para ChP por injeção ICV de AAV2/5-shRNA ou CRE-TAT O papel de A2AR na ChP como um poderoso regulador da informação neural na patogênese do EAE permanece obscuro. Derrubar a expressão de A 2A R específica de ChP poderia lançar luz sobre os efeitos regulatórios de A2AR no sistema imunológico central em EAE e outras inflamações do sistema nervoso. Este estudo usou a injeção ICV de CRE-TAT para diminuir a expressão d...

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Aqui, descrevemos um método para alterar seletivamente a expressão gênica no plexo coroide, evitando qualquer impacto em outras áreas cerebrais.

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

O objetivo desta pesquisa é investigar as técnicas de manipulação da expressão gênica no plexo coroide. Nosso estudo introduziu os dois métodos que permitem a técnica exclusivamente no plexo coroide, sem qualquer impacto discernível em outras regiões. Nossos achados podem potencialmente melhorar futuros estudos da função do plexo coroide em neurociência.Nossa pesquisa revisou que inibir a infiltração de células T através do plexo coroide através do bloqueio seletivo de adenosina para um receptor é suficiente para proteger camundongos da patologia EAE. Esse achado reforça a noção de que a detecção da atividade porta de entrada no plexo coroide poderia representar uma nova estratégia promissora para o tratamento da esclerose múltipla. Este estudo apresenta dois métodos alternativos para manipulação da expressão gênica no plexo coroide.Injeção de ICV de Cre recombinase nesses camundongos transgênicos ou injeção de ICV de AAV2/5, ou é alvo de SHI nos camundongos WT. Esses métodos superam problemas com a promoção da especificidade e do melhoramento transgenético de camundongos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

687 visualizações.  Wenzhou Medical University. O objetivo desta pesquisa é investigar as técnicas de manipulação da expressão gênica no plexo coroide. Nosso estudo introduziu os dois métodos que permitem a técnica exclusivamente no plexo coroide, sem qualquer impacto discernível em outras regiões. Nossos achados podem potencialmente melhorar futuros estudos da função do plexo coroide em neurociência.Nossa pesquisa revisou que inibir a infiltração de células T através do plexo coroide através do bloqueio seletivo d...

Vídeo: Autor em destaque: Insights e inovações em técnicas de manipulação de expressão gênica para pesquisa do plexo coróide 

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and pathological conditions. Recent research has shown that regulating ChP activity may offer protection against CNS disorders. However, studying the biological function of the ChP without affecting other brain regions is challenging due to its delicate structure. This study presents a novel method for gene knockdown in ChP tissue using adeno-associated viruses (AAVs) or cyclization recombination enzyme (Cre) recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT). The results demonstrate that after injecting AAV or CRE-TAT into the lateral ventricle, the fluorescence was exclusively concentrated in the ChP. Using this approach, the study successfully knocked down the adenosine A2A receptor (A2AR) in the ChP using RNA interference (RNAi) or Cre/locus of X-overP1 (Cre/LoxP) systems, and showed that this knockdown could alleviate the pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This technique may have important implications for future research on the ChP's role in CNS disorders.

Here, we describe a method to selectively alter gene expressions in the choroid plexus while avoiding any impact in other brain areas.

Neurociência

ChP Specific Knockdown of A2ARs with AAV2/5-shRNA and Cre/LoxP System

ChP Specific Knockdown of A2ARs with AAV2/5-shRNA and Cre/LoxP System  

To begin, place the anesthetized mice on the surgical platform. After trimming the hair, apply eye ointment down both eyes to prevent them from drying. Then fix the mice onto a stereotaxic apparatus for immobilization.Make a small incision under a microscope to fully expose the skull. Prepare two 10 microliter syringes, one containing AAV2/5-adenosine 2A receptor shRNA, and the other containing AAV2/5 scramble. Then use the microscope to locate the bregma and lambda and set the coordinate point on the 10 microliter syringe based on the mouse brain stereotaxic atlas.Drill a small hole in the skull at the established coordinate point. Inject two microliters of AAV2/5-Adenosine 2A receptor shRNA virus into the brain ventricle via lateral injection at a steady rate of 100 nanoliters per minute. Keep the needle in place for 10 minutes before withdrawing.Seal the injured skin promptly using medical bio fibrin glue to prevent virus loss. Place the mouse on a heating pad, maintaining its body temperature approximately at 37 degrees Celsius to facilitate recovery. Inject two microliters of CRE-TAT Recombinase into each lateral ventricle of Arosa L-D-L-T-D tomato mouse for the experimental group, and two microliters of sterile PBS for the control group.Two weeks after the CRE-TAT Recombinase injection, prepare frozen tissue sections, perform nuclear staining and prepare the slide for imaging Knocking down adenosine 2A receptor in the choroid plexus in homozygous adenosine 2A receptor fluxed mouse, using CRE-TAT, led to decreased EAE clinical scores. Similarly, knocking down choroid plexus in adenosine 2A receptor wild-type mice, using AAV2/5 shRNA decreased EAE clinical scores. The QPCR analysis showed that the mRNA levels of adenosine 2A receptor decreased in the AAV2/5 shRNA and CRE-TAT groups, compared to each control.Silencing adenosine 2A receptor, specifically in the choroid plexus, reduced immune cell infiltration into the spinal cord.