Este trabalho foi apoiado pelo Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2021YJ0175).

O protocolo e os procedimentos experimentais receberam aprovação do Comitê Administrativo e de Pesquisa Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Número de registro: 2022DL-010). Ratos machos Sprague Dawley (SD), com oito semanas de idade, pesando entre 180 e 200 g, foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) e alojados sob um ciclo claro/escuro natural com temperatura (23 ± 2 °C) e umidade relativa (55% ± 10%) controladas. Doze ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: grupo controle e grupo RA. Todos os ratos foram aclimatados a essas condições e receberam acesso gratuito a comida e água por uma semana antes do experimento.
1. Estabelecimento de um modelo de RA em ratos
<ol><li>Preparo da solução sensibilizante: suspender 30 mg de ovalbumina (OVA) e 3 g de Al(OH)3 em 100 mL de solução salina (ver Tabela de Materiais)14,15.</li>
	<li>Sensibilização básica: segure e segure o rato totalmente acordado com o abdômen voltado para cima. Desinfete o abdômen usando bolas de algodão embebidas em álcool a 75%. Utilizar uma seringa de 1,5 ml para injectar 1 ml da solução sensibilizante preparada no passo 1.1 na cavidade abdominal esquerda dos ratos do grupo RA. Repetir esta injeção uma vez a cada dois dias durante 14 dias (Figura 1A). NOTA: Certifique-se de que a cabeça do rato está posicionada mais abaixo da cauda para evitar danos aos intestinos grosso e delgado ao inserir a seringa. O local da injeção está localizado a 1,5 cm da linha média ventral. Os ratos do grupo controle devem receber injeções intraperitoneais de 1 mL de solução salina normal uma vez a cada dois dias por 14 dias.</li>
	<li>Provocação nasal: Administrar 50 μL de OVA a 5% por meio de gotas nasais utilizando pipeta de 100 μL (Figura 1B) no dia seguinte à sensibilização basal, repetindo este procedimento por 7 dias (Figura 1C). NOTA: Preparar a solução de OVA a 5% misturando 5 g de OVA com 100 ml de solução salina. Para o grupo controle, administrar gotas do mesmo volume de soro fisiológico.</li>
</ol>2. Escore comportamental de ratos
<ol><li>Dentro de 30 min após completar o teste nasal final, observar e registrar os ratos usando uma câmera digital para identificar sintomas como coçar o nariz, espirrar e coriza, com base nos critérios de pontuação descritos na Tabela 1 (Figura 1D). NOTA: A confirmação de que a modelagem de RA bem-sucedida é baseada na obtenção de uma pontuação total de ≥5 pontos14.</li>
</ol>3. Obtenção de amostras de mucosa nasal
<ol><li>Sacrificar ratos: sacrificar os ratos expondo-os a uma overdose de CO2. Depois, desinfetar os ratos com etanol a 75% (ver Tabela de Materiais). Utilizar bisturi para incisão nos dois cantos da boca para exposição do tecido muscular (Figura 2A). Em seguida, cortar as articulações do osso zigomático e da mandíbula em ambos os lados do crânio com tesoura de tecido (Figura 2B) e remover a mandíbula (Figura 2C).</li>
	<li>Exposição da cavidade nasal: separar a pele da maxila com hemostático (Figura 2D) para expor a cavidade nasal (Figura 2E). Cortar a conexão óssea entre a cavidade nasal e a maxila com tesoura de tecido (Figura 2F). Em seguida, cortar a conexão entre a cavidade nasal e os ossos orbitários de ambos os lados no forame infraorbital (Figura 2G) e remover a cavidade nasal (Figura 2H).</li>
	<li>Fixação: colocar a cavidade nasal extraída em paraformaldeído a 4% para fixação e armazená-la em temperatura ambiente por 24-72 h (ver Tabela de Materiais). NOTA: Certifique-se de que a quantidade de paraformaldeído fixador utilizada é suficiente para cobrir completamente as seções para a fixação adequada.</li>
</ol>4. Pré-processamento de amostras de mucosa nasal
<ol><li>Descalcificação: comece fixando os tecidos retirados a partir do passo 3.1. Lave-os três vezes com PBS por 20 min cada. Em seguida, lave-os três vezes com água destilada, cada vez por 20 min. Posteriormente, descalcifique os tecidos em uma solução de descalcificação com um volume de 20-30 vezes o dos tecidos à temperatura ambiente.<ol><li>A solução de descalcificação (ver Tabela de Materiais) deve manter um pH de 7,2-7,4. Finalmente, coloque o tecido descalcificado em uma caixa de desidratação. NOTA: A solução descalcificante precisa ser trocada semanalmente. O processo de descalcificação pode ser concluído quando o tecido amolece (aproximadamente 2 meses).</li>
	</ol></li>
	<li>Desidratação e depilação: transfira a caixa de desidratação para um desidratador (ver Tabela de Materiais). Comece com álcool 75% por 4 h, seguido por álcool 85% por 2 h, álcool 90% por 2 h e álcool 95% por 1 h.<ol><li>Em seguida, imergir o tecido em etanol anidro por 30 min, repetir o processo por mais 30 min, usar xileno por 5-10 min, repetir essa etapa por mais 5-10 min, imergir o tecido em cera por 1 h, repetir essa etapa por mais uma hora e, finalmente, imergir o tecido em cera por mais 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporação: coloque o bloco de cera derretida na caixa de incorporação (consulte Tabela de Materiais) e guarde-o em um freezer de -20 °C. Assim que a cera se solidificar, retire-a e apague o bloco de cera.</li>
	<li>Fatiamento: insira o bloco de cera aparado em micrótomo de parafina (ver Tabela de Materiais) e corte-o em fatias com espessura de 3 μm. Coloque as fatias em banho-maria a 40 °C sobre um espalhador de lâminas. Achate o tecido, levante-o com uma lâmina de vidro e leve ao forno a 60 °C.<ol><li>Depois que a água tiver evaporado e a cera estiver devidamente ajustada, remova as lâminas e armazene-as a uma temperatura de 25 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Coloração H&E do tecido da mucosa nasal
<ol><li>Desparafinação e hidratação: coloque as fatias em xileno por 20 min, repita o processo por mais 20 min, etanol absoluto por 5 min, repita essa etapa por mais 5 min, álcool 75% por 5 min e, por fim, lave por 5 min.</li>
	<li>Coloração de hematoxilina: dispensar 100 μL de solução corante de hematoxilina (ver Tabela de Materiais) por 3-5 min usando uma pipeta de 100 μL, enxaguar por 5-10 s, adicionar 100 μL de etanol de ácido clorídrico a 0,5% por 10-30 s, enxaguar por 5-10 s, adicionar 100 μL de água de amônia a 0,2% por 10-30 s e enxaguar por 30 s. NOTA: Após a coloração com hematoxilina, a diferenciação com etanol de ácido clorídrico a 0,5% é necessária para remover o excesso de corante hematoxilina ligado ao núcleo e absorvido pelo citoplasma. Quando a coloração de eosina é realizada, os núcleos e o citoplasma serão claramente corados. As fatias aparecerão vermelhas ou rosas após a diferenciação com etanol de ácido clorídrico a 0,5%, então enxágue imediatamente após a diferenciação para remover o ácido das fatias de tecido para interromper a diferenciação. Em seguida, use 0,2% de água de amônia para melhorar a coloração nuclear.</li>
	<li>Coloração de eosina: utilizar uma pipeta de 100 μL para dispensar 100 μL de solução corante de eosina (ver Tabela de Materiais) por 5 min e enxaguar por 30 s.</li>
	<li>Desidratação e selagem: imergir as fatias em etanol absoluto por 5 min, repetir o processo por mais 5 min, repetir novamente por 5 min, dimetil por 5 min e xileno por 5 min. Por fim, selar com resina neutra (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Colocação do corte corado no microscópio: posicione o corte corado no microscópio, ajuste o foco do microscópio até que a imagem fique claramente visível, ajuste o aumento para 40x e capture a imagem.</li>
</ol>6. Imunomarcação multicolor do tecido da mucosa nasal
<ol><li>Desparafinação e hidratação: siga o mesmo mencionado no passo 5.1.</li>
	<li>Tratamento tampão citrato-fosfato: colocar o tampão citrato-fosfato (pH 6,0) (ver Tabela de Materiais) em um recipiente seguro para micro-ondas. Aqueça até ferver, remova-o e, em seguida, adicione as lâminas ao recipiente. Leve ao micro-ondas em fogo médio por 8 min até ferver, desligue o fogo por 8 min e mude para fogo médio-baixo por 7 min.<ol><li>Após o resfriamento natural, transfira as fatias para PBS (pH 7,4), agite e lave-as três vezes com um agitador descolorante, cada vez por 5 min. NOTA: Certifique-se de que o tampão não evapora durante este processo e evite que as fatias sequem.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueio da peroxidase endógena: secar as fatias, desenhar um círculo ao redor do tecido com uma caneta imunohistoquímica (para evitar que o anticorpo flua) e aplicar solução de peróxido de hidrogênio a 3% (peróxido de hidrogênio: água pura = 1:9).<ol><li>Incubar à temperatura ambiente no escuro durante 15 minutos. Após o resfriamento natural, coloque as fatias em PBS (pH 7,4) e agite-as em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueio: aplicar 5% de soro de cabra dentro do círculo e incubar por 30 min.</li>
	<li>Adição de anticorpos primários: remova suavemente a solução de bloqueio, adicione FOXP3 (diluição: 1:200, ver Tabela de Materiais) ao corte e coloque-o numa câmara húmida. Incubar a 4 °C durante a noite. NOTA: Adicione uma pequena quantidade de água à câmara úmida para evitar a evaporação de anticorpos.</li>
	<li>Adição de anticorpos secundários: colocar as fatias em PBS (pH 7,4) e agitá-las em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada. Seque suavemente as fatias e aplique o anticorpo secundário (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, ver Tabela de Materiais) dentro do círculo. Incubar à temperatura ambiente durante 50 minutos no escuro.</li>
	<li>Preparação da solução de diluição de tiramida: combinar 100 μL de 3% H 2 O2com 100 ml de 1x TBST (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Adição de solução de trabalho TSA: Misturar 1 ml de diluente de tiramida com 2 μL de CY3-tiramida para preparar a solução de trabalho TSA. Aplicar 100 μL de solução de trabalho TSA em cada fatia e incubar à temperatura ambiente no escuro durante 10 minutos. Em seguida, lave as fatias com PBS três vezes, 5 min cada vez. NOTA: Preparar e utilizar imediatamente a solução de trabalho TSA e armazená-la a 4 °C no escuro; É válido por até 24 h.</li>
	<li>Repita os passos 6.2-6.8: mudar para uma diluição de 1:200 de RORγt (corante fluorescente FITC) e, em seguida, para uma diluição de 1:200 de TICAM1 (corante TYP620) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Núcleos contracorados com DAPI: agitar suavemente as fatias para secá-las, aplicar solução corante DAPI e incubar à temperatura ambiente por 10 min no escuro.</li>
	<li>Têmpera autofluorescente: colocar as fatias em PBS (pH 7,4) e agitá-las em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada. Aplique o quencher de autofluorescência (ver Tabela de Materiais) nas fatias, aguarde 5 min e lave por 10 min.</li>
	<li>Bloqueio: colocar as fatias em PBS (pH 7,4) e agitá-las em um agitador descolorante por três ciclos de 5 min cada. Agite suavemente as fatias para secá-las e selá-las com o quencher antifluorescência (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Microscopia: colocar o corte corado no microscópio, ajustar o foco do microscópio para visibilidade clara, ajustar o aumento para 20x e 40x e capturar a imagem. NOTA: DAPI tem um comprimento de onda de excitação UV de 330-380 nm e um comprimento de onda de emissão de 420 nm (luz azul). O FITC tem um comprimento de onda de excitação de 465-495 nm e um comprimento de onda de emissão de 515-555 nm (luz verde). CY3 tem um comprimento de onda de excitação de 510-560 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm (luz vermelha). TYP-690 tem um comprimento de onda de excitação de 630 nm e um comprimento de onda de emissão de 690 nm (luz rosa).</li>
</ol>

Imunofluorescência Multicolorida do Tecido Nasal em Modelo de Rato com Rinite Alérgica

<ol>
	<li>Bro&#380;ek, J. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+and+the+regulation+of+Treg/Th17+differentiation.">Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation.</a> Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).</li><li>Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+research+advances+of+toll-like+receptors+and+allergic+rhinitis.">Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis.</a> Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).</li><li>Shan, H., Jie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+TLR4+gene+polymorphisms+and+allergic+rhinitis.">Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis.</a> Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).</li><li>Xu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+mechanism+of+Treg+cells+and+TICAM-1+patients+with+severe+allergic+rhinitis.">Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis.</a> Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1+CD8++T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+hpv-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+automated+quantitative+analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li><li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1/PD-L1+checkpoint+blockade:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li><li>Hernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+for+immune+cell+profiling+of+paraffin-embedded+tumor+tissues.">Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória não infecciosa da mucosa nasal resultante de uma combinação de fatores ambientais e genéticos. Tornou-se um problema de saúde global, impactando a eficiência do trabalho, diminuindo a qualidade de vida, prejudicando o sono, a função cognitiva e causando irritabilidade e fadiga. A RA afeta 10%-20% da população mundial¹ e acarreta custos econômicos substanciais, causando perdas anuais de até 30-50 bilhões de euros nos países da UE18...

A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E (IgE) específica1,2. É caracterizada por sintomas como espirros, coriza, congestão nasal e prurido nasal. Com a industrialização e urbanização, a prevalência da RA vem aumentando gradativamente, afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial1. A técnica de imunofluorescência (IF) é um método de coloração fluorescente que utiliza uma reação de ligação anticorpo-antígeno. Pode ser empregado para detectar e quantificar os níveis de distribuição e expressão de proteínas específicas em tecidos biológicos ou células. Na pesquisa de RA, o FI pode detectar simultaneamente múltiplos alvos, incluindo citocinas relacionadas à RA, células inflamatórias, receptores e muito mais, facilitando a exploração da patogênese da RA e dos efeitos de drogas 3,4,5,6.
O processo de coloração por imunofluorescência multicolor (mIF) se assemelha muito ao FI tradicional, com a adição de uma etapa de eluição de anticorpos durante cada rodada de coloração. Essa modificação permite a detecção simultânea de múltiplos biomarcadores na mesma seção de tecido por meio de marcação única sequencial e várias rodadas de recoloração. O mIF é baseado na amplificação do sinal da tiramida (TSA), permitindo ciclos repetidos de coloração fluorescente de TSA e o uso de aquecimento por micro-ondas para remover anticorpos enquanto retém sinais fluorescentes 7,8. Em comparação com o FI convencional, o mIF oferece várias vantagens: (1) pode detectar antígenos fracamente expressos que são difíceis de identificar com o IF convencional 9,10; (2) proporciona coloração de alta qualidade com melhor relação sinal-ruído; (3) permite quantificar estruturas tecido-específicas e regiões de interesse11; (4) a multiplexação de múltiplas vias utiliza tecidos de forma eficiente e conserva recursos patológicos limitados12; (5) a análise multiparamétrica por meio do mIF oferece informações mais profundas sobre os tecidos, revelando informações biológicas ocultas13.
De modo geral, o mIF permite a observação de diferentes expressões e distribuições de antígenos dentro de uma mesma amostra, facilitando o estudo das proteínas-alvo. No futuro, pesquisadores que buscam entender a expressão e distribuição de múltiplas proteínas-alvo encontrarão essa técnica como uma escolha valiosa. Este estudo demonstra a aplicação do mIF na coloração de amostras de mucosa nasal de ratos com RA e avalia o estabelecimento de um modelo de RA em ratos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Al(OH)3</td>
			<td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% ethanol</td>
			<td>Anhui Yiren An Co., Ltd</td>
			<td>20210107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021070101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022070501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescence quenching sealer</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic dyeing machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Varistain Gemini ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier slides</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-phosphate buffer&#160;</td>
			<td>Servicebio biotechnology co., Ltd</td>
			<td>G1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid antigen repair solution (PH 6.0)</td>
			<td>Xavier Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td>
			<td>CS01-2450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3-Tyramide</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1223-50UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring shaker</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>S1010E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA decalcification solution</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CR2203047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating blast dryer&#160;</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding box marking machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>&#160;PrintMate AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast tissue dewatering machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>STP420 ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film sealer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Autostainer 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Tyramide</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1222-50UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Sunny Optical Technology Co.Ltd</td>
			<td>CX40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>bs-10211R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing table</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Liankebio Co., Ltd</td>
			<td>GAR0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DH0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sichuan Xilong Science Co., Ltd</td>
			<td>210608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical pen</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BC004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Midea</td>
			<td>M1-L213B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral gum</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin&#160;</td>
			<td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A804010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palm centrifuge</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>D1008E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>P0099-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathology section scanner</td>
			<td>3DHISTECH Kft</td>
			<td>Pannoramic SCAN&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>KE0003087/KA0056573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ror&#947;t</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>DF3196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd</td>
			<td>20170022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B</td>
			<td>Bioengineering Co., Ltd</td>
			<td>A602008-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td>
			<td>PC2-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rats</td>
			<td>Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine</td>
			<td>SYX <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65937/65937eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 2023-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TICAM-1</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>DF6289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td>
			<td>J22120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue spreading baking sheet machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JK-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYR-690 fluorescent dyes</td>
			<td>Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RC0086-34RM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>SLK-O3000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath-slide drier</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JK-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax trimmer</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JXL-818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022051901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling in nasal mucosa tissue sections of allergic rhinitis rats via multicolor immunoassay

A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E específica (IgE), afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial. Enquanto a coloração por imunofluorescência (IF) tem sido uma técnica padrão para detectar a expressão de proteínas doença-específicas, as técnicas convencionais de FI são limitadas em sua capacidade de detectar os níveis de expressão de três ou mais proteínas na mesma amostra. Consequentemente, técnicas de FI multicolorido têm sido desenvolvidas nos últimos anos, que permitem a marcação simultânea de múltiplos alvos em células ou tecidos.
Este protocolo fornece uma visão abrangente do processo para o estabelecimento de um modelo de RA em ratos, obtenção de amostras de mucosa nasal e procedimentos técnicos para imunofluorescência multicolorida. Todos os ratos do grupo RA apresentaram sintomas típicos como espirros, coriza e coceira no nariz, com observações comportamentais pontuando ≥5 pontos. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) revelou aumento da contagem de células inflamatórias e integridade da mucosa nasal no grupo RA. A imunofluorescência multicolor (mIF) demonstrou aumento da expressão de RORγt e TICAM-1, enquanto a expressão de Foxp3 diminuiu no tecido da mucosa nasal de ratos RA.

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE)1,2. It is characterized by symptoms such as sneezing, a runny nose, nasal congestion, and nasal itching. With industrialization and urbanization, the prevalence of AR is gradually increasing, affecting approximately 10%-20% of the world&#39;s population1. The immunofluorescence (IF) technique is a fluorescent staining method that utilizes an antibody-antigen binding reaction. It can be employed to detect and quantify the distribution and expression levels of specific proteins in biological tissues or cells. In AR research, IF can simultaneously detect multiple targets, including AR-related cytokines, inflammatory cells, receptors, and more, facilitating the exploration of AR pathogenesis and the effects of drugs3,4,5,6.
The multicolor immunofluorescence (mIF) staining process closely resembles traditional IF, with the addition of an antibody elution step during each round of staining. This modification enables the simultaneous detection of multiple biomarkers on the same tissue section through sequential single-labeling and multiple rounds of re-staining. mIF is based on tyramide signal amplification (TSA), allowing for repeated cycles of TSA fluorescent staining and the use of microwave heating to remove antibodies while retaining fluorescent signals7,8. In comparison to conventional IF, mIF offers several advantages: (1) it can detect weakly expressed antigens that are challenging to identify with conventional IF9,10; (2) it provides high-quality staining with an improved signal-to-noise ratio; (3) it allows for the quantification of tissue-specific structures and regions of interest11; (4) multiplexing multiple pathways efficiently utilizes tissues and conserves limited pathological resources12; (5) multi-parameter analysis through mIF offers deeper insights into tissues, uncovering hidden biological information13.
Overall, mIF allows the observation of different antigen expressions and distributions within the same sample, facilitating the study of target proteins. In the future, researchers seeking to understand the expression and distribution of multiple target proteins will find this technique a valuable choice. This study demonstrates the application of mIF for staining nasal mucosa samples from rats with AR and evaluate the establishment of a rat model of AR.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de rinite alérgica com imunofluorescência multicolorida

Marcação por Imunofluorescência em Cortes de Tecido da Mucosa Nasal de Ratos com Rinite Alérgica via Imunoensaio Multicolorido

Our main research is based on a study of allergic rhinitis. Our research intends to analyze what proteins are associated with allergic rhinitis. Multicolor immunofluorescence is currently used to advance research in our field.In future studies, we will focus on the possible mechanisms of TCM in the treatment of allergic rhinitis.

Seis ratos SD foram induzidos com sucesso no modelo de RA através de injeção intraperitoneal de OVA e desafio nasal. A RA foi induzida em todos os ratos do grupo RA, correspondendo a 100% do grupo. Todos os ratos do grupo RA apresentaram sintomas típicos como espirros, coriza e coceira no nariz. Todas as observações comportamentais obtiveram pontuação ≥5 pontos (Tabela 2).
Os resultados da coloração H&E no21º dia de modelagem revelaram que, nos ratos co...

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Este protocolo descreve uma técnica de imunofluorescência multicolor para avaliação do modelo de rinite alérgica em ratos.

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), ...

Nossa principal pesquisa é baseada em um estudo de rinite alérgica. Nossa pesquisa pretende analisar quais proteínas estão associadas à rinite alérgica. A imunofluorescência multicolor é atualmente utilizada para o avanço das pesquisas em nosso meio.Em estudos futuros, enfocaremos os possíveis mecanismos da MTC no tratamento da rinite alérgica.

immunofluorescent-labeling-nasal-mucosa-tissue-sections-allergic

Research

JoVE Journal

Medicine

Immunofluorescent Labeling in Nasal Mucosa Tissue Sections of Allergic Rhinitis Rats via Multicolor Immunoassay

1.1K visualizações.  Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. Nossa principal pesquisa é baseada em um estudo de rinite alérgica. Nossa pesquisa pretende analisar quais proteínas estão associadas à rinite alérgica. A imunofluorescência multicolor é atualmente utilizada para o avanço das pesquisas em nosso meio.Em estudos futuros, enfocaremos os possíveis mecanismos da MTC no tratamento da rinite alérgica.

Vídeo: Autor em destaque: Avançando na pesquisa de rinite alérgica com imunofluorescência multicolorida

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), affecting approximately 10%-20% of the world's population. While immunofluorescence (IF) staining has long been a standard technique for detecting disease-specific protein expression, conventional IF techniques are limited in their ability to detect the expression levels of three or more proteins in the same sample. Consequently, multicolor IF techniques have been developed in recent years, which allow the simultaneous labeling of multiple targets in cells or tissues.
This protocol provides a comprehensive overview of the process for establishing a rat model of AR, obtaining nasal mucosal samples, and the technical procedures for multicolor immunofluorescence. All rats in the AR group exhibited typical symptoms such as sneezing, a runny nose, and an itchy nose, with behavioral observations scoring &#8805;5 points. Hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining revealed increased inflammatory cell counts and disrupted nasal mucosal integrity in the AR group. Multicolor immunofluorescence (mIF) demonstrated increased expression of ROR&#947;t and TICAM-1, while Foxp3 expression decreased in the nasal mucosa tissue of AR rats.

This protocol describes a multicolor immunofluorescence technique for evaluating the rat model of allergic rhinitis.

Medicina

Acquisition and Pre-Processing of Nasal Mucosal Samples from Rats with Allergic Rhinitis

To begin, with a scalpel, make a precise incision along the two corners of the mouth of a euthanized rat to expose the muscle tissue. Use a pair of tissue scissors to cut the joints of the zygomatic bone and the mandible on both sides of the skull. Then remove the mandible.Use tissue scissors to cut the bony connection between the nasal cavity and the maxilla. Then use a hemostat to separate the skin of the maxilla to expose the nasal cavity. Sever the connection between the nasal cavity and the orbital bones on both sides at the infraorbital foramen, and remove the nasal cavity.Place the extracted nasal cavity in a 4%Paraformaldehyde solution for fixation. To decalcify the tissue, wash the fixed tissue with distilled water. Place the tissues in a decalcification solution with a volume 20 to 30 times that of the tissues at room temperature.Once decalcification is complete, place the tissue in a dehydration box. Transfer the dehydration box to a dehydrator and dehydrate the tissue in increasing alcohol concentrations at different incubation times. Next, place the tissue in anhydrous ethanol for 30 minutes for two cycles.Following this, transfer the tissue to xylene for five to 10 minutes and repeat, then immerse the tissue in wax for one hour. Place the wax block in embedding cassettes. Remove the wax blocks after they have solidified and trim the wax block.Insert the trimmed wax block into a paraffin microtome and cut it into three micrometer thick slices. Hematoxylin and eosin staining of the control rats showed well arranged and cilia. The nasal septum mucosa was damaged and detached in the disease group with notable neutrophil infiltration.

Aquisição e Pré-Processamento de Amostras de Mucosa Nasal de Ratos com Rinite Alérgica

Multicolor Immunostaining of Nasal Mucosal Tissues of Rats with Allergic Rhinitis

To begin, place the hematoxylin and eosin stained rat nasal mucosal tissue sections onto a microscope stage. Adjust the microscope's focus until the image is clearly visible. Capture the tissue image at 40X.Heat the citrate phosphate buffer until it boils. Then add the slides to the container after removing it from the heat. After heating for eight minutes until boiling, turn off the heat for eight minutes and subsequently switch to medium low heat for seven minutes.After allowing the container to cool naturally transfer the slices to PBS. Use a decolorizing shaker to shake the slices for five minutes. Next draw a circle around the dried tissue with an immunohistochemical pen.Add 3%hydrogen peroxide solution to the slices before incubating. Then transfer the slices to PBS for washing as before. To block, apply 5%goat serum within the marked circle.After incubation, carefully remove the blocking solution and add one to two milliliters of FOXP3 to the tissue slices. Then place the slices in a humid chamber for overnight incubation. After washing the slices in PBS, gently dab the slices dry with filter paper.Then add one to two milliliters of the secondary antibody solution to the slices. Next incubate the slices in 100 microliters of tyramide signal amplification working solution for 10 minutes at room temperature in the dark. After incubation, wash the slices with PBS three times for five minutes each.Now apply one to two milliliters of DAPI staining solution to the slices before incubation. Quench the auto fluorescence by incubating the slices in the quencher for five minutes before a 10 minute PBS wash. Then seal them with the anti fluorescence quencher.Capture the microscopic images of the stained sections under 20X and 40X magnification. Hematoxylin and eosin staining of the control rats showed well arranged epithelial cells and cilia. The nasal septum mucosa was damaged and detached in the disease group with notable neutrophil infiltration.Multi immunofluorescent staining revealed that the expressions of ROR Gamma T and TCAM1 were increased in the disease group. However, FOXP3 was under expressed.