Os autores são gratos ao Laboratório de Andrologia do Centro de Medicina Reprodutiva, o Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen, por fornecer as instalações para este estudo. Nenhum financiamento foi envolvido na elaboração deste artigo.

Este estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen.
1. Preparação da solução de trabalho
<ol><li>Reunir os seguintes reagentes essenciais para a preparação da solução de trabalho - solução de substrato de orto-toluidina, solução saturada de cloreto de amónio (NH4Cl), solução de sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético a 148 mmol/L (EDTANa 2) e solução de peróxido de hidrogénio a 6% (v/v). Coloque-os em uma bancada de laboratório à temperatura ambiente (RT) juntamente com as ferramentas necessárias, como pipetas de transferência (1000 μL, 200 μL, 10 μL) e racks de tubo de ensaio. CUIDADO: Leia a ficha de dados de segurança (SDS) antes de manusear os reagentes acima mencionados.</li>
	<li>Prepare um frasco de reagente marrom opaco para armazenar e proteger a solução de trabalho preparada da exposição à luz.</li>
	<li>Transfira os reagentes para o frasco de reagente marrom opaco de acordo com as proporções especificadas abaixo:<ol><li>Utilize a pipeta de transferência de 200 μL e ajuste a escala para 100 μL girando o botão. Em seguida, transfira 100 μL da solução NH4Cl para o frasco de reagente marrom opaco.</li>
		<li>Substitua a ponta da pipeta e transfira 100 μL da solução de EDTA de 148 mmol/L Na2para o frasco de reagente marrom opaco usando a pipeta de transferência de 200 μL mencionada acima. Em seguida, sopre suavemente por pipetagem e homogeneize completamente a solução.</li>
		<li>Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 900 μL girando o botão. Em seguida, transfira 900 μL da solução do substrato orto-toluidina para o frasco de reagente marrom opaco, sopre suavemente por pipetagem e homogeneize completamente a solução.</li>
		<li>Utilize a pipeta de transferência de 10 μL e ajuste a escala para 5 μL girando o botão. Em seguida, transfira 5 μL da solução de peróxido de hidrogênio a 6% (v/v) para o frasco de reagente marrom opaco.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 1000 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, sopre suavemente por pipetagem e homogeneize completamente a solução no frasco de reagente marrom opaco.</li>
	<li>Armazene a solução de trabalho pronta para utilização no frasco de reagente marrom opaco em RT, longe da luz. A solução de trabalho é reativa por 24 horas.</li>
	<li>Cada amostra de sémen requer 900 μL da solução de trabalho. Assegurar que a quantidade da solução de trabalho preparada diariamente corresponde ao número de amostras examinadas diariamente.</li>
</ol>2. Preparação da amostra de sémen
<ol><li>Antes de coletar a amostra de sêmen, certifique-se de que o paciente tenha se abstido da ejaculação por 2 a 7 dias, conforme exigido pelo manual laboratorial da Organização Mundial da Saúde (OMS) para examinar e processar o sêmen humano (5ª ed.) 8. A masturbação é o método preferido para a obtenção de amostras de sêmen. Para melhorar a precisão do exame, instrua o paciente a coletar todo o sêmen ejaculado.</li>
	<li>Ligue o suporte de temperatura constante e aqueça até 37 °C com antecedência para que a liquefação subsequente da amostra de sêmen possa prosseguir sem problemas.</li>
	<li>Após o recebimento da amostra de sêmen do paciente, registre meticulosamente informações detalhadas, incluindo código de identificação, tempo de coleta, duração da abstinência e outras informações pertinentes, na parede externa do recipiente à base de polímero.</li>
	<li>Coloque o recipiente à base de polímero que abriga a amostra de sêmen no suporte de temperatura constante pré-aquecido a 37 °C, o que é benéfico para a liquefação do sêmen.</li>
	<li>Aspirar a amostra de sémen para uma pipeta à base de polímero e observar o estado de liquefação a cada 5 minutos até que a amostra de sémen esteja totalmente liquefeito.</li>
	<li>Se a amostra de sémen não tiver sido totalmente liquefeita no prazo de 30 minutos, não realize ainda o exame; Continue a esperar por mais 30 min. Se o sémen ainda não estiver totalmente liquefeito após 60 minutos, adicionar um volume igual de solução tampão fosfato para uma diluição de 1:1 e agitar suavemente para promover a liquefação.</li>
	<li>Após agitação completa e homogeneização consistente, retenha a amostra de sêmen totalmente liquefeito para os procedimentos de exame subsequentes.</li>
</ol>3. Coloração dos leucócitos peroxidase positiva e análise da amostra de sêmen original
<ol><li>Antes da amostragem, utilize uma pipeta à base de polímero para soprar repetidamente por pipetagem e homogeneizar completamente a amostra de sêmen sob exame.</li>
	<li>Utilize a pipeta de transferência de 200 μL e ajuste a escala para 100 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta e, em seguida, transfira 100 μL da amostra de sémen para um tubo de centrifugação.</li>
	<li>Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 900 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta e, em seguida, transfira 900 μL da solução de trabalho acima mencionada para o tubo da centrífuga.</li>
	<li>Sopre repetidamente por pipetagem e homogeneize completamente o reagente, que consiste na amostra de sêmen e na solução de trabalho, usando a pipeta de transferência de 1000 μL.</li>
	<li>Posicione o tubo da centrífuga em um rack de tubo de ensaio sobre um agitador bidimensional e submeta-o a agitação contínua a 200 rpm por 30 min no RT.</li>
	<li>Enquanto aguarda a reação de coloração, analise a amostra de sêmen utilizando o sistema CASA para determinar a concentração de espermatozoides na amostra de sêmen original no recipiente à base de polímero.<ol><li>Ligue o interruptor de alimentação do sistema CASA e clique duas vezes no ícone SCA SCOPE para abrir o software do aplicativo.</li>
		<li>Antes da amostragem, soprar repetidamente por pipetagem e homogeneizar completamente a amostra de sêmen original novamente com uma pipeta à base de polímero.</li>
		<li>Utilize a pipeta de transferência de 10 μL e ajuste a escala para 10 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, pipetar 10 μL da amostra de sêmen original e colocá-la na câmara de contagem SCA. Aguarde 60 s para que a amostra de sêmen pare de derivar.</li>
		<li>Posicione a câmara de contagem da SCA no porta-amostras do sistema CASA e defina as informações do paciente na caixa de diálogo do software aplicativo para se preparar para o exame formal.</li>
		<li>Examine a amostra de sêmen original na câmara de contagem da SCA com o sistema CASA clicando no botão Iniciar e registre os dados necessários, como a concentração de espermatozoides.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Observação dos leucócitos e espermatozoides positivos para peroxidase
<ol><li>Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 1000 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, depois sopre repetidamente por pipetagem e homogeneize completamente o reagente, que consiste em amostra de sêmen e solução de trabalho no tubo da centrífuga novamente no final do processo de reação de 30 minutos.</li>
	<li>Utilize a pipeta de transferência de 10 μL e ajuste a escala para 10 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, pipetar até 10 μL do reagente mencionado acima e colocá-lo na câmara de contagem de espermatozoides. Finalmente, cubra a câmara de contagem de espermatozoides com uma tampa de vidro dedicada.</li>
	<li>Coloque a câmara de contagem de espermatozoides no palco microscópico e ligue o interruptor de energia do microscópio óptico com duas oculares de 10x. Em seguida, aguarde 60 s para que a amostra de reagente pare de derivar.</li>
	<li>Troque o conversor microscópico para a lente objetiva de 10x durante o tempo de espera. Em seguida, ajuste o botão de ajuste grosso e o botão de ajuste fino em sequência. Finalmente, observe os espermatozoides e as células redondas sob um aumento de 10×10.</li>
	<li>Trocar o conversor microscópico para a objetiva de 40x após determinar o campo de visão a ser analisado e observar os espermatozoides e leucócitos marrom peroxidase positiva sob um aumento de 10 × 40.</li>
	<li>Utilize o sistema de contador eletrônico para contar pelo menos 200 espermatozoides e o número de leucócitos positivos para peroxidase marrom dentro dos campos correspondentes.</li>
</ol>5. Cálculo da concentração de leucócitos peroxidase positiva
<ol><li>Calcular a concentração de leucócitos positivos para peroxidase utilizando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66211/66211eq01v2.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>

Análise de sêmen para células leucocitárias positivas para peroxidase

<ol>
	<li>Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+view+on+male+infertility+around+the+globe.">A unique view on male infertility around the globe.</a> Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).</li><li>Sharlip, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practice+policies+for+male+infertility.">Best practice policies for male infertility.</a> Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).</li><li>Choy, J. T., Eisenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+infertility+as+a+window+to+health.">Male infertility as a window to health.</a> Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).</li><li>Pellati, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genital+tract+infections+and+infertility.">Genital tract infections and infertility.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).</li><li>Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+management+of+male+genital+tract+infections+in+the+setting+of+male+infertility:+an+updated+review.">Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review.</a> Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).</li><li>Long, S., Kenworthy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+cells+in+diagnostic+semen+analysis:+A+guide+for+laboratories+and+clinicians.">Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians.</a> Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).</li><li>Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+'round+cells'+in+semen+analysis:+a+comparative+study.">Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study.</a> Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WHO+Laboratory+Manual+for+the+Examination+and+Processing+of+Human+Semen.+5th+edn.">WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn.</a> World Health Organization. , (2010).</li><li>Domes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+and+effect+of+bacteriospermia+and+elevated+seminal+leukocytes+on+semen+parameters.">The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters.</a> Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).</li><li>Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+associations+between+specific+sperm+morphological+defects+and+leukocytospermia.">Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia.</a> Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).</li><li>Alahmar, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+oxidative+stress+in+male+infertility:+An+updated+review.">Role of oxidative stress in male infertility: An updated review.</a> J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).</li><li>Schlegel, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+infertility+in+men:+AUA/ASRM+guideline+Part+I.">Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I.</a> J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).</li><li>Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+detection+in+human+semen+using+flow+cytometry.">Leukocyte detection in human semen using flow cytometry.</a> Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).</li><li>Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+guidelines+for+the+evaluation+and+treatment+of+leukocytospermia+in+male+infertility.">Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility.</a> World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).</li><li>Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+as+an+active+disease+biomarker:+recent+biochemical+and+pathological+perspectives.">Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives.</a> Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).</li><li>Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+pathological+studies+on+peroxidases+-an+updated+review).">Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review).</a> Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).</li><li>Liu, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-derived+hypochlorous+acid+promotes+ox-LDL-induced+senescence+of+endothelial+cells+through+a+mechanism+involving+beta-catenin+signaling+in+hyperlipidemia.">Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia.</a> Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).</li><li>Nicholls, S. J., Hazen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+and+cardiovascular+disease.">Myeloperoxidase and cardiovascular disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).</li><li>Wolff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biologic+significance+of+white+blood+cells+in+semen.">The biologic significance of white blood cells in semen.</a> Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).</li><li>Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertonic+saline+enhances+neutrophil+elastase+release+through+activation+of+P2+and+A3+receptors.">Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).</li><li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+destruction+by+neutrophils.">Tissue destruction by neutrophils.</a> N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A orto-toluidina e o peróxido de hidrogênio têm propriedades fotossensíveis e podem se decompor quando expostos à luz. Para garantir a eficácia dos reagentes de teste, recomenda-se que o fluido de trabalho preparado seja armazenado em um local escuro. 
As amostras de sêmen naturalmente exibem características heterogêneas. No processo de preparação de amostras de sêmen, julgar corretamente o estado de liquefação do sêmen e homogeneizar completamente as amostras de sêmen antes de...

A infertilidade emergiu como um problema de saúde pública global que afeta aproximadamente 15% dos casais em idade reprodutiva. Os fatores masculinos são responsáveis por cerca de 50% do total de casos de subfertilidade, e cerca de 20% a 30% podem ser atribuídos exclusivamente aos fatores masculinos 1,2,3. As infecções do trato genital masculino (ITMG) constituem uma das causas significativas de infertilidade masculina, sendo responsáveis por cerca de 15% dos casos 4,5.
A maioria dos indivíduos possui leucócitos no sêmen, constituindo 13% das células não espermáticas, sendo as proporções diferenciais neutrófilos 12%, macrófagos 0,9% e linfócitos 0,1%6,7. De acordo com o manual laboratorial da Organização Mundial da Saúde (OMS) para exame e processamento de sêmen humano (5ª ed.), a leucocitospermia é usualmente definida como a presença de leucócitos >1 ×10 6 células/mL no sêmen8. Essa condição pode ser causada por inúmeros fatores, como toxinas ambientais, abuso de substâncias, varicoceles, MGTIs, etc., todos potencialmente levando a um aumento anormal da concentração leucocitária no sêmen9. Os leucócitos podem elevar os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) no sêmen, causando peroxidação lipídica e danos oxidativos à proteína e ao DNA, o que resulta em diminuição da motilidade dos espermatozoides, aumento das anormalidades morfológicas dos espermatozoides, aumento do índice de fragmentação do DNA dos espermatozoides, comprometimento da função acrossomal dos espermatozoides e até mesmo impactos negativos no desenvolvimento embrionário10,11.
Atualmente, os andrologistas geralmente optam por examinar células redondas no sêmen ou elastase no plasma seminal ao identificar a inflamação do trato genital. No entanto, muitas vezes é desafiador distinguir as células espermatogênicas esfaceladas das células epiteliais do trato reprodutivo, que não contribuem para reduzir o uso indiscriminado e desnecessário de antibióticos6. Este último método de exame é relativamente complicado e demorado, com notificação lenta dos resultados, o que não é benéfico para o diagnóstico precoce e tratamento de doenças como os ITMG. A American Urological Association (AUA) sugere que uma maior diferenciação entre leucócitos e células esfaceladas do trato genital deve ser feita quando a concentração de células redondas na análise do sêmen for maior que 1 × 106 células/mL12. Alguns laboratórios de andrologia utilizam citometria de fluxo13 ou imunocitoquímica de antígenos leucocitários (por exemplo, CD45)14 para examinar leucócitos. Embora esses métodos sejam precisos, são caros e demorados, dificultando a implementação clínica em larga escala, especialmente em países em desenvolvimento.
A peroxidase é amplamente distribuída em vários tipos de células e desempenha um papel crucial na resistência ao dano do estresse oxidativo. A mieloperoxidase (MPO) é um membro da subfamília das peroxidases que é geralmente expressa em células imunes. É mais altamente expressa nos grânulos azurofílicos dos neutrófilos15,16 e também é expressa em linfócitos17,18, monócitos e macrófagos19. A concentração de leucócitos, especialmente neutrófilos, no sêmen pode ser obtida pelo exame de células redondas positivas para peroxidase 7,20. Para tornar o processo de exame de leucócitos no sêmen econômico, conveniente e eficiente, reformulamos o método de exame. Assistida pelo sistema de análise seminal assistida por computador (CASA), a concentração de leucócitos pode ser obtida em 60 min. Esse novo método reduz os custos dos exames dos pacientes e o tempo de espera para a obtenção dos resultados, alivia a carga de trabalho dos técnicos de laboratório e encurta o período de espera para diagnóstico e tratamento do médico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution</td>
			<td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD</td>
			<td>20230301</td>
			<td>Agentia B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6% (v/v) hydrogen peroxide solution</td>
			<td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD</td>
			<td>20230301</td>
			<td>Agentia D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Sperm Class Analyzer &#8211; SCA SCOPE&#160;</td>
			<td>Microptic S.L.</td>
			<td>1222996; Model type: SCA-SCOPE-H</td>
			<td>Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable centrifugal tube (1.5 mL)</td>
			<td>Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD</td>
			<td>2210009</td>
			<td>Centrifugal tube for Staining process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipette (3 mL)</td>
			<td>Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD</td>
			<td>20221101</td>
			<td>Polymer-based pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic counter</td>
			<td>None</td>
			<td>None</td>
			<td>A multichannel counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic scales</td>
			<td>Shanghai Liangping Instrument Co., LTD</td>
			<td>D9008084</td>
			<td>MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Makler counting chamber</td>
			<td>Makler</td>
			<td>MQ30004</td>
			<td>0.01 sq.mm, 10 &#956;m deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>3G41067201307</td>
			<td>CX31, 10&#215;40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ortho-toluidine substrate solution</td>
			<td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD</td>
			<td>20230301</td>
			<td>Agentia C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips(1 mL)</td>
			<td>Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd</td>
			<td>02923205</td>
			<td>1000 tips/unit, 5 units/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips(10 &#181;L)</td>
			<td>Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd</td>
			<td>00323961</td>
			<td>1000 tips/unit, 20 units/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips(200 &#181;L)</td>
			<td>Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd</td>
			<td>32822810</td>
			<td>1000 tips/unit, 20 units/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution</td>
			<td>ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD</td>
			<td>20230301</td>
			<td>Agentia A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCA counting chamber</td>
			<td>Microptic S.L.</td>
			<td>102230608</td>
			<td>10 &#181;m, 2 Chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The container for semen sample</td>
			<td>Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD</td>
			<td>20230701</td>
			<td>Polymer-based receptacle for semen sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic table</td>
			<td>Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD</td>
			<td>MQ30004</td>
			<td>MQ-300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette (10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendoff</td>
			<td>3121000.015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendoff</td>
			<td>3121000.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette (200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendoff</td>
			<td>3121000.082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-dimensional shaker</td>
			<td>DragonLab</td>
			<td>822000010000</td>
			<td>VC5A002205</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the examination of peroxidase-positive leukocytes in semen

A leucocitospermia pode levar à diminuição da motilidade dos espermatozoides, aumento das anormalidades morfológicas dos espermatozoides, índice de fragmentação do DNA dos espermatozoides elevados, comprometimento da função acrossômica dos espermatozoides e até mesmo desenvolvimento embrionário afetado. É uma doença andrológica comum na prática clínica e uma das importantes causas de infertilidade masculina. Ao determinar se a inflamação do trato reprodutivo masculino existe, os andrologistas geralmente optam por examinar as células redondas ou a elastase plasmática seminal no sêmen como base de diagnóstico clínico. No entanto, o exame de células redondas é facilmente influenciado por células espermatogênicas descamadas e células epiteliais do trato reprodutivo, que não contribuem para reduzir o uso indiscriminado e desnecessário de antibióticos. Ao mesmo tempo, o processo de detecção da elastase é relativamente complicado, demorado e lento na comunicação de resultados, o que não é benéfico para o diagnóstico precoce e tratamento de doenças como infecções do trato genital masculino (ITMG). Aplicamos de forma inovadora o exame de leucócitos peroxidase positiva em sêmen assistido por um sistema de análise seminal assistida por computador (CASA) como critério diagnóstico para leucocitospermia, resolvendo com sucesso esses problemas. Este exame requer apenas a adição do fluido operacional composto por quatro reagentes na amostra, e o tempo total de reação à temperatura ambiente pode ser controlado dentro de 20-30 min. Com o esfregaço subsequente e o exame microscópico, a concentração de leucócitos positivos para peroxidase no sêmen pode ser obtida dentro de um total de 60 min, que pode ser usado para diagnosticar se a inflamação do trato reprodutor masculino existiu.

Infertility has emerged as a global public health issue affecting approximately 15% of couples in their reproductive age. Male factors are contributed by around 50% of total subfertility cases, and nearly 20% to 30% can be attributed solely to male factors1,2,3. Male genital tract infections (MGTIs) constitute one of the significant causes of male infertility, accounting for about 15% of cases4,5.
Most individuals have leukocytes in their semen, constituting 13% of non-spermatozoan cells, with differential proportions being neutrophils 12%, macrophages 0.9%, and lymphocytes 0.1%6,7. According to the World Health Organization (WHO) laboratory manual for the examination and processing of human semen (5th ed.), leukocytospermia is usually defined as the presence of &#62;1 &#215; 106 cells/mL leucocytes in semen8. This condition can be caused by numerous factors such as environmental toxins, substance abuse, varicoceles, MGTIs, etc., all potentially leading to an abnormal increase in leukocyte concentration in semen9. Leukocytes can elevate reactive oxygen species (ROS) levels in semen, causing lipid peroxidation and oxidative damage to protein and DNA, which results in decreased spermatozoa motility, increased spermatozoa morphological abnormalities, elevated spermatozoa DNA fragmentation index, impairment of the spermatozoa acrosome function, and even negative impacts on embryo development10,11.
Currently, andrologists commonly choose to examine round cells in semen or elastase in seminal plasma when identifying genital tract inflammation. However, it&#39;s often challenging to distinguish sloughed spermatogenic cells and reproductive tract epithelial cells, which do not contribute to reducing the indiscriminate and unnecessary use of antibiotics6. The latter examination method is relatively complicated and time-consuming, with slow result reporting, which is not beneficial for early diagnosis and treatment of diseases such as MGTIs. The American Urological Association (AUA) suggests further differentiation between leukocytes and sloughed cells from the genital tract should be made when the round cell concentration in semen analysis is greater than 1 &#215; 106 cells/mL12. Some andrology labs utilize flow cytometry13 or leukocyte antigen (e.g., CD45) immunocytochemistry14 to examine leukocytes. While these methods are precise, they are expensive and time-consuming, making large-scale clinical implementation difficult, especially in developing countries.
Peroxidase is widely distributed in various types of cells and plays a crucial role in the resistance to oxidative stress damage. Myeloperoxidase (MPO) is a member of the peroxidase subfamily that is generally expressed in immune cells. It is most highly expressed in neutrophils&#39; azurophilic granules15,16 and is also expressed in lymphocytes17,18, monocytes, and macrophages19. The concentration of leukocytes, especially neutrophils, in semen can be obtained by examining round cells that are peroxidase-positive7,20. To make the examination process of leukocytes in semen economical, convenient, and efficient, we reengineered the examination method. Assisted by the computer-assisted semen analysis (CASA) system, the concentration of leukocytes can be obtained within 60 min. This new method reduces the patients&#39; examination costs and waiting time for obtaining results, alleviates the workload of lab technicians, and shortens the doctor&#39;s diagnosis and treatment waiting period.

Autor em destaque: um método simples e econômico para análise de leucócitos em sêmen 

O Exame de Leucócitos Peroxidase Positivos no Sêmen

Ao implementar o procedimento supracitado, o reagente no tubo da centrífuga frequentemente manifesta aspecto subtranslúcido e opalescente (Figura 1). A detecção de uma cor obviamente marrom revela potencial degranulação de leucócitos, o que pode resultar em coloração líquida. Consequentemente, o processo de coloração pode falhar, tornando necessário recolorir ou coletar uma nova amostra de sêmen para novo teste21.
Os leucócit...

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Este trabalho apresenta um protocolo econômico e eficiente para o exame de leucócitos peroxidase positiva no sêmen. Com o auxílio de um sistema de análise seminal assistida por computador (CASA), a concentração de leucócitos positivos para peroxidase no sêmen pode ser obtida em um total de 60 min, melhorando efetivamente a eficiência do laboratório de andrologia e dos andrologistas.

Leukocytospermia can lead to decreased spermatozoa motility, increased spermatozoa morphological abnormalities, elevated spermatozoa DNA fragmentation ...

A medicina reprodutiva masculina é meu principal foco de pesquisa, e nosso protocolo aborda principalmente as questões de velocidade e custo na análise de leucócitos positivos para peroxidase no sêmen. O sêmen é inerentemente heterogêneo, o que afeta sobremaneira a estabilidade dos resultados da análise seminal. Portanto, é essencial garantir que o sêmen seja liquefeito e completamente misturado antes do exame.Nosso protocolo combina métodos manuais e automáticos para calcular a concentração de leucócitos utilizando a concentração espermática, o que economiza tempo e é mais econômico em comparação com os leucócitos prontos para contagem.

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Research

JoVE Journal

Medicine

The Examination of Peroxidase-Positive Leukocytes in Semen

3.1K visualizações.  The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. A medicina reprodutiva masculina é meu principal foco de pesquisa, e nosso protocolo aborda principalmente as questões de velocidade e custo na análise de leucócitos positivos para peroxidase no sêmen. O sêmen é inerentemente heterogêneo, o que afeta sobremaneira a estabilidade dos resultados da análise seminal. Portanto, é essencial garantir que o sêmen seja liquefeito e completamente misturado antes do exame.Nosso protocolo combina métodos manuais e automáticos para calc...

Vídeo: Autor em destaque: um método simples e econômico para análise de leucócitos em sêmen 

Leukocytospermia can lead to decreased spermatozoa motility, increased spermatozoa morphological abnormalities, elevated spermatozoa DNA fragmentation index, impairment of the spermatozoa acrosome function, and even affected embryonic development. It is a common andrological disease in clinical practice and one of the important causes of male infertility. When determining whether male reproductive tract inflammation exists, andrologists often choose to examine round cells or seminal plasma elastase in the semen as a clinical diagnostic basis. However, the examination of round cells is easily influenced by sloughed spermatogenic cells and reproductive tract epithelial cells, which do not contribute to reducing the indiscriminate and unnecessary use of antibiotics. At the same time, the detection process of elastase is relatively complicated, time-consuming, and slow in reporting results, which is not beneficial for early diagnosis and treatment of diseases such as male genital tract infections (MGTIs). We have innovatively applied the examination of peroxidase-positive leukocytes in semen assisted by a computer-assisted semen analysis (CASA) system as a diagnostic criterion for leukocytospermia, successfully solving these problems. This examination only requires the addition of the operating fluid consisting of four reagents into the specimen, and the total reaction time at room temperature can be controlled within 20-30 min. With the subsequent smear and microscopic examination, the concentration of peroxidase-positive leukocytes in semen can be obtained within a total of 60 min, which can be used to diagnose whether the inflammation of the male reproductive tract existed.

This paper presents an economical and efficient protocol for examining peroxidase-positive leukocytes in semen. With the assistance of a computer-assisted semen analysis (CASA) system, the concentration of peroxidase-positive leukocytes in semen can be obtained within a total of 60 min, effectively improving the efficiency of andrology laboratory and andrologists.