Desenvolvemos um protocolo robusto em que várias rodadas de hibridização in situ podem ser realizadas no mesmo cérebro de drosófila, permitindo a visualização dos padrões de expressão de muitos genes diferentes. A incorporação do cérebro da mosca em um hidrogel garante excelente integridade do tecido e estabilidade do mRNA em várias rodadas de hibridização. Também melhora significativamente a clareza óptica ao criar imagens.
O EASI-FISH pode ser adotado por qualquer laboratório com um microscópio confocal ou de folha de luz para definir perfis de expressão gênica de tipos de células no cérebro da mosca. Para começar, limpe uma lâmina não carregada com um reagente de descontaminação de RNA. Remova a película opaca que protege o adesivo da junta de silicone.
Em seguida, cole a junta contendo até quatro câmaras na corrediça. Use uma pipeta P20 para revestir cada superfície da câmara com um microlitro de polilisina. Em seguida, transfira até quatro cérebros de drosófila por tubo para um tubo de PCR de 0,2 mililitro.
Reidrate os cérebros em 150 microlitros de PBS contendo 0,1% de Triton X-100 seguido de PBS. Adicione 40 microlitros de PBS em cada câmara. Com uma pinça fina, posicione suavemente os cérebros em uma fileira no centro da câmara, deixando algum espaço entre eles.
Remova o PBS da câmara e adicione imediatamente 50 microlitros de tampão MOPS de 20 milimolares. Enquanto os cérebros estão se equilibrando no tampão MOPS, pipete volumes iguais de Melphalan-X descongelado em um tubo com tampão MOPS de volume igual. Em seguida, adicione a solução estoque Ac-X na proporção de um para 100.
Vortex a solução e gire-a brevemente para coletá-la. Remova todo o tampão MOPS das câmaras e adicione 50 microlitros da solução Melphalan-X Ac-X. Coloque uma lamínula no topo de cada câmara sem usar o adesivo de vedação para vedação.
Em seguida, coloque a câmara em uma caixa umidificada. No dia seguinte, remova cuidadosamente a lamínula e aspire a solução Melphalan-X Ac-X. Lave os cérebros montados duas vezes em 100 microlitros de 0,1% PBT, seguidos por 100 microlitros de PBS.
Coloque as soluções descongeladas de TREx-1000 4-Hydroxy-TEMPO, TEMED e persulfato de amônio no gelo. Vortex a solução TREx-1000 para garantir que não haja precipitado. Misture as soluções para preparar uma solução de gel e vórtice antes de congelar.
Com uma ponta de pipeta, remova o PBS da câmara e remova qualquer líquido residual com um pano sem fiapos. Adicione imediatamente 40 microlitros de solução de gel sobre os cérebros em cada câmara. Incube as câmaras a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Agora remova a solução de gel da câmara. Em seguida, retire a película protetora transparente do adesivo da superfície da junta. Adicione 45 microlitros finais de solução de gel fresco.
Coloque suavemente uma lamínula sobre a câmara e pressione a lamínula para selar a câmara antes de incubar a quatro graus Celsius por mais 10 minutos. Incube a câmara a 37 graus Celsius por 1,5 horas para polimerizar o gel. Depois de resfriar os géis em uma bancada, use uma lâmina de barbear para remover cuidadosamente a lamínula e a junta de silicone.
Apare o gel em uma forma retangular e corte o canto superior direito para indicar a orientação da amostra. Em seguida, use um pincel fino umedecido com uma pequena quantidade de tampão Pro K para retirar cuidadosamente os géis da lâmina. Transfira cada gel individualmente para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.
Misture 500 microlitros de tampão Pro K e cinco microlitros da enzima Proteinase K e adicione a mistura a cada gel. Incube a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, remova o tampão com uma pipeta fina e flexível e lave os géis três vezes em PBS por 10 minutos cada.
Incube os géis por 30 minutos em um mililitro de tampão DNASE1 a 37 graus Celsius. Misture 50 microlitros da enzima DNASE1 com 450 microlitros de tampão DNASE1. Misture delicadamente sem vórtice.
Incubar cada gel em 500 microlitros de solução DNASE1 por duas horas a 37 graus Celsius. Em seguida, lave os géis quatro vezes por 15 minutos com um mililitro de PBS em temperatura ambiente. Agora, incube os géis em 500 microlitros de tampão de hibridização descongelado sem sondas por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Diluir as sondas em tampão de hibridização na proporção de um para 100, preparando 300 microlitros por gel. Incube os géis com tampão de hibridização contendo sondas durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, lave os géis primeiro no tampão de lavagem da sonda e depois no PBS.
Para a reação em cadeia de hibridização, adicione 500 microlitros de tampão de amplificação ao gel e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Aqueça os grampos de cabelo fluorescentes a 95 graus Celsius por 90 segundos em uma máquina de PCR e resfrie a solução a 25 graus Celsius por 30 minutos. Para cada sonda, dilua os pares de grampos de cabelo correspondentes em uma proporção de um para 50 no tampão de amplificação, preparando 300 microlitros por gel.
Após o vórtice da mistura, adicione a mistura aos géis e incuba. Para montar o gel para imagens de folha leve, cubra a superfície de fixação do gel de um suporte de gel duas vezes com um microlitro de polilisina, deixando-o secar a 37 graus Celsius entre as demãos. Em seguida, coloque o gel em uma lamínula para que o corte fique do lado esquerdo.
Usando um pincel, transfira o gel para a superfície tratada em um movimento. Genes associados a neurotransmissores e genes neuropeptídicos exibiram padrões de expressão distintos no cérebro adulto de drosófila. VGluT e Gad1 foram codetectados na mesma rodada de hibridização, mostrando padrões de expressão não sobrepostos.
AstA mostrou expressão forte no lobo óptico e expressão mais fraca no complexo central. Crz foi altamente expresso na pars lateralis, enquanto níveis mais baixos de expressão foram observados nos neurônios do lobo óptico. Tk foi detectado em neurônios H delta D identificados com expressão de Mer-GFP usando uma linha GAL4 dividida específica por folha de luz ou microscopia confocal.
FMRFamida estava ausente nos neurônios PFG marcados por Mer-GFP, mas detectado nos neurônios circundantes. Imagens de alta resolução de neurônios FB4K confirmaram a distribuição espacial dos transcritos VGluT e ChAT/VAChT. Neuropeptídeos, como AstA e Crz, são tão altamente expressos em algumas células que pontos fluorescentes individuais representando transcritos únicos não podem mais ser separados.
