РНК-интерференция в клещи

Резюме

Метод РНК-интерференции (RNAi) путем инъекции дсРНК в голодные клещи описывается. RNAi является наиболее широко используемой генной глушителей технику в клещи, где использование других методов генетических манипуляций носит ограниченный характер.

Аннотация

Клещи являются облигатными гематофагами эктопаразиты диких и домашних животных и людей, и считается вторым по всему миру для комаров как переносчиков болезней человека, ¹ и наиболее важных векторов, влияющих скота промышленности во всем мире ^2. Клещи, классифицируются в подклассе Acari, порядок Parasitiformes, подотряда Ixodida и распространяются по всему миру от Арктики до тропических регионах ^3. Несмотря на усилия по контролю тик насекомых, это эктопаразитов остаются серьезной проблемой для здоровья человека и животных ^4,5.

РНК-интерференция (RNAi) ⁶ на основе нуклеиновой кислоты обратный генетический подход, который включает в себя нарушение экспрессии генов, чтобы определить функции гена или его влияние на метаболические пути. Малых интерферирующих РНК (siRNAs) являются эффекторные молекулы путем РНК-интерференции, который проводится по инициативе двухцепочечной РНК (дсРНК) и приводит к мощным последовательности конкретных деградации мРНК, содержащих цитоплазматические же последовательности, что триггером дсРНК ^7-9. После транскрипционных генов механизмы инициирован дсРНК были обнаружены у всех эукариот изучены до сих пор, и RNAi была быстро развивается в самых разных организмов, как инструмент для исследования функциональной геномики и других приложений, ^10.

RNAi стало наиболее широко используемых генной глушителей технику в клещи и другие организмы, где альтернативные подходы в генетических манипуляций отсутствуют или являются ненадежными ^5,11. Генетической характеристики клещей было ограничено до недавнего применения РНК-интерференции ^12,13. В короткое время, что RNAi была доступна, она оказалась ценным инструментом для изучения функции генов тик, характеристика клеща возбудителя интерфейс и отбор и характеристика тик защитных антигенов ^14. При этом, метод РНК-интерференции путем инъекции дсРНК в голодные клещи описано. Вполне вероятно, что знания, полученные из этого экспериментальный подход будет способствовать заметно на понимание основных биологических систем и разработка вакцин для контроля тик инвазии и предотвращения передачи клещевого патогенов ^15-19.

протокол

1. Генерация дсРНК.

1. Синтез олигонуклеотидных праймеров, содержащих последовательности T7 промотор для транскрипции в пробирке и синтез дсРНК (например, для Dermacentor variabilis subolesin использованием олигонуклеотидных праймеров D8AAT75:
   5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'и D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3').
2. Amplify гена-мишени ОТ-ПЦР, используя 10 пмоль каждого праймера и олигонуклеотида 1-10 нг РНК тик общего количества.
3. Purify продукта ПЦР.
4. Обобщить дсРНК использовании 8 мкл продукта ПЦР очищенная.
5. Количественная дсРНК по-спектрометрии.

2. Инъекция тики с дсРНК.

2.1. Подготовка клещей для инъекций.

1. Во-первых, мыть клещей в серии решений, встряхивая их в каждом решении в 50 мл одноразовые трубки центрифуги, разливая раствор через мелкое сито проволочной сетки по трубке сверху сохранить клещей. Последовательность решений для мытья клещей водопроводной воды, 3% перекись водорода, два моет дистиллированной воды, 70% этанола и еще два моет дистиллированной водой.
2. Пятно сухой клещей на бумажных полотенцах.
3. Граф клещей на группы от 20 до 50, в зависимости от эксперимента, место клещей из каждой группы в 1,25 пластиковом стакане г с подогнаны крышки и этикетки с экспериментальными номер группы.

2.2. Тик инъекции команды.

Команда RNAi состоит из трех человек: (1) один человек, который позиции каждого тика на двойной клейкой ленты прикреплены к листу красной зубных слепков, (2) один человек, который вводит клещей и (3) один человек, который следит за клещей после инъекции, дышит CO ₂ на клещей, чтобы активировать их и подсчитывает жизни клещей в чашки помечены экспериментальные номер группы. Все члены команды должны носить одноразовые перчатки.

2.3. Размещение клещей для инъекций.

1. Захват тик использованием Дюмон штраф пинцетом и поместить его брюшной стороне на двойной клейкой ленты прикреплены к 3 "х 6" лист красной стоматологического воска. Клещей близко расположены вместе в группы по 5 клещей.
2. Место небольшую полоску клейкой ленты на ротовых всех 5 тиков в целях дальнейшего удержать их, но, оставляя большую часть тела подвергается, так что инъекции процесс можно наблюдать тик инжектора (рис. 1).

2.4. Инъекция клещей.

1. Тиков будет введен в правом нижнем квадранте брюшной поверхности экзоскелет.
2. Во-первых, пробить отверстие в экзоскелет с помощью шприца Monoject инсулина оснащены ½ ", 29 иглы (рис. 2а).
3. Inject клещей сразу же с 0,2-0,5 мкл раствора дсРНК (5 х ¹⁰ 10 - 5 х 10 ¹¹ молекул в мкл) с использованием заказных Гамильтон шприц с 1 дюйм, 33 иглы с 45 ° скошенной точке (рис. 2б) . Иглы должны быть размещены также в тик полости, чтобы обеспечить размещение и хранение дсРНК. Некоторые жидкости, скорее всего, побег из места инъекции (рис. 2в). Следует проявлять осторожность, чтобы не вводить в течение клещей, которые будут вызывать потерю гемолимфы и может привести к гибели клеща.
4. Чистая шприца Гамильтона после окончания инъекций в каждой экспериментальной группы. Перед использованием для другой экспериментальной группе. Заполните шприц сначала из стакана, содержащий 3% перекиси водорода, а затем высылать в контейнер для отходов, и повторите 15 раз. Заполните шприц из стакан, содержащий стерильной водой, а затем высылать в контейнер для отходов, и повторите 15 раз. Будьте осторожны, чтобы не погнуть поршень шприца Гамильтона, потому что, если изогнуты, поршень не будет двигаться плавно и реагировать на нежные прикосновения, необходимых для введения клещей.

2.5. Лечение клещей после инъекции.

1. Возьмите вводят непосредственно из тика двойной клейкой ленты с тонким пинцетом и поместить его в пластиковый контейнер восстановления (примерно 6 "х 6" и кольчатой ​​с клейкой лентой, чтобы предотвратить побег клещи). Клещи будут кратко неактивные после инъекции, но в ближайшее время должен начать ползать блюдо.
2. Дыхание CO ₂ на клещей сразу же после помещения их в контейнер для восстановления помочь активировать клещей. Как только клещи ползут и активным, инъекции рана будет заживать быстрее, и они, скорее всего, выжить.
3. Граф клещей в зависимости от количества в каждой экспериментальной группы и поместите их в пластиковый стаканчик помечены с подогнаны крышкой. Замена клещей должен быть введен, чтобы заменить какой-либо, что любой умер перед инъекцией следующего экспериментальной группе.

2.6. Тик холдинга.

1. Место клещей в камере влажности (12hr свет: 12 ч темно фотопериода на 22-25 ° С и 95% относительной чumidity) и удерживайте в течение 1 дня.
2. Место клещей в тик-питание клеток, по одному в экспериментальной группе, приклеены к овцам и дать им возможность кормиться с равным количеством uninjected мужчина или женщина клещей (в зависимости от пола не вводили). Женский клещи, которые питаются в сытости, те, которые удаляются из овец через 10 дней после кормления или когда контроль самок высадили хост собираются и взвешиваются.
3. Место клещей в картонных коробках, и держать в камере влажности до окончания яйцекладки. Оценка откладки яиц путем взвешивания яичная масса производимого всеми клещей в группе.

2.7. Анализ клеща фенотипа после RNAi.

1. Оценка тик фенотипа после кормления, определяя количество тактов, которые выжили, отметьте вес, откладки яиц и яичных плодородия. Тем не менее, другие анализы могут быть выполнены в зависимости от целевого гена и задачи исследования.

3. Анализ для подтверждения генов ОТ-ПЦР.

1. Рассеките слюнных желез и кишки от отдельных клещей из-под контроля впрыска и дсРНК впрыском групп после кормления.
2. Извлечение общей РНК из отдельных образцов ткани.
3. Анализ стенограмм гена-мишени в отдельных тканей в режиме реального времени RT-PCR и нормализовать уровни РНК против клещевого 16S рРНК использованием genNorm метод (метод ddCT как осуществляется Bio-Rad iQ5 Standard Edition, версия 2.0).
4. Выполнить диссоциации кривых в конце реакции, чтобы только один ампликона формируется и что ампликонов денатурировать последовательно в том же диапазоне температур для каждого образца.
5. Сравнить уровни мРНК (нормированные значения Ct) между контролем впрыском и дсРНК впрыском клещей использованием Студенческие т-тест (р = 0,05).

4. Представитель Результаты:

Протокол, описанный в этом документе, были использованы в нашей лаборатории для RNAi в самых разных видов иксодовых тики (табл. 1). Количество дсРНК вводят клещей зависит от размера тика; больше видов клещей может вместить больший объем. Отрицательные клещей контроль должен быть введен с несвязанными дсРНК. Несколько dsRNAs таких как subolesin ^{14-19,22-25,27-32,34} и бета-актин ^20,21 можно использовать в качестве положительного контроля. Обратите внимание, что очень важно, чтобы вымыть шприц между курсами лечения, чтобы избежать смешивания растворов дсРНК. Если протокол будет сделано правильно, менее чем на 5% смертности должны быть получены из процедуры инъекции через 24 часа. Типичный фенотип гена после нокдауна в тактах показано на рисунке 3 с панели клещи вводят пулов дсРНК для того, чтобы показать на экране для клещ защитных антигенов.

Тик видов	дсРНК вводили	Ссылки
Ixodes scapularis	кДНК библиотеки, subolesin, актин, нуклеотидазы, NF-Кб, akirin	21, 22, 29, 30
Dermacentor variabilis	subolesin, GST, убиквитин, vATPase, селенопротеинов M и W2A, гемопоэтических стволовых / прогениторных клеток белка, как, актин протеасомы 26S субъединицы, ferritin1, varisin, akirin	15, 19, 22, 24, 26, 30-32
Dermacentor marginatus	subolesin	22
Amblyomma americanum	кДНК библиотеки, subolesin, akirin	17, 22, 30
Amblyomma hebraeum	subolesin, voraxin	28
Rhipicephalus шпеиз	Rs86, subolesin	22, 23
Rhipicephalus MicroPlus	GST, убиквитин, селенопротеина, Bm86, Bm91, subolesin Г.И., GIII, EF1a, жгутовидные шелковые белка, фон Виллебранда фактор	16, 18, 25, 27
Rhipicephalus аппиШиз	убиквитин, subolesin, EF1a, GIII	16

Таблица 1. Tick видов, в которых РНК-интерференции протокол был использован.

Рисунок 1. Размещение клещей, вентральной стороной вверх, на двойной клейкой лентой придерживался лист красной стоматологического воска. Клещей помещаются в группы по 5, после чего небольшую полоску клейкой ленты находится над ротовые в целях дальнейшего безопасного клещей, позволяя наблюдать инжектор тело клеща во время инъекции.

Рисунок 2. Инъекции процедура включает в себя (а) пирсинг правом нижнем квадранте тик экзоскелет с инсулином сиRinge оснащен 29 иглу, чтобы создать месте инъекции, (б) немедленное введение дсРНК на этом сайте, используя шприц Гамильтон с 33 иглы которых (с), скорее всего, приведет к некоторой утечке клещей гемолимфы / жидкости.

Рисунок 3. Панели клещей шесть групп, в которых РНК-интерференции был использован для выявления тик защитных антигенов в Amblyomma americanum. Фенотипические изменения у клещей можно увидеть при сравнении с положительным subolesin RNAi контроля и отрицательных связанных контроль дсРНК. В этом эксперименте влияние RNAi в кредит смертности, веса и откладки яиц в каждой группе было статистически проанализированы.

Обсуждение

Хотя другие методы были описаны для RNAi в ^{14 клещей, 33,} инъекции дсРНК описанная здесь наиболее широко используется как в голодные (табл. 1) и подается клещей ^16,25,34. RNAi было показано, что ценный инструмент для исследования клещей функции гена, характеристика клеща возбудителя интерфейс и отбор и характеристика тик защитных антигенов ^14,35. В частности, RNAi стал самым ценным инструментом для функционального анализа в клещи ^35.

Методологически RNAi, скорее всего, превратится в более эффективных методов, которые могут позволить гена нокдаун в большое количество людей. Механизм дсРНК вызванные РНК-интерференции в тиках следует доработать, чтобы способствовать лучшему пониманию и использованию этого генетического подхода у этого вида ^35,36. Степень вне целевой эффекты RNAi в тактах также важный вопрос, который должен быть полностью рассмотрены ^14,27. Наконец, RNAi, скорее всего, обеспечить всестороннюю вклад в изучение клещей регуляции генов и системной биологии и клещей возбудитель интерфейс и может иметь влияние на разработку вакцин для контроля тик заражения и передачи клещевого патогенов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Access RT-PCR system	Promega	A1250
Purelink PCR purification kit	Invitrogen	K3100-02
Megascript RNAi kit	Ambion	AM1626M
Red dental wax	Electron Microscopy Sciences	72674
Plastic cups, 1.25 oz and lids	Solo Cup Company, Urbana Ill.
Fine forceps	Electron Microscopy Sciences	Various
Insulin syringe	Monoject		Fitted with a ½", 29 gauge needle
Hamilton syringe	Hamilton	701SN,33/.375”/45DGR	Custom made
TriReagent	Sigma	93289
iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green	Bio-Rad	170-8892
Real-time PCR detection system	Bio-Rad	Several	Please refer to http://www.bio-rad.com/