Подготовка интактного говядине Хвост межпозвоночных дисков для органной культуры

Резюме

Этот протокол иллюстрирует уборки методика копчикового бычьего межпозвоночных дисков для органа культуры В пробирке Органной культуры.

Аннотация

Межпозвонкового диска (IVD) является стык соединения позвоночника позвонка к позвонку. Он функционирует передавать загрузку позвоночника и придаст гибкость позвоночника. Она слагается из трех отсеков: внутренний пульпозного ядра (НП), охватывающий от фиброзного кольца (AF) и два хрящевых концевые соединения Н. П. и А. Ф. в тело позвонка с обеих сторон. Дискогенная боль может быть вызвана дегенеративных заболеваний межпозвоночных дисков (DDD) и дисковые грыжи была определена в качестве одной из основных проблем в нашем современном обществе. Для изучения возможных механизмов IVD дегенерации, в пробирке органной культуры систем с живыми клетками диск очень привлекательным. В пробирке культуру нетронутым бычьего копчикового IVDs зашел настолько далеко, соответствующие модели системы, которая позволяет изучение механо-биологические аспекты в хорошо контролируемых физиологических и механических окружающей среды. Говядина IVDs хвост может быть получен сравнительно легко в большем количествеD очень похожи на человеческие поясничного IVDs по отношению к плотности клеток, клеточной популяции и размеров. Тем не менее, предыдущие бычьей хвостовой IVD методы добычи сохраняя хрящевые и костные концевые концевые удалось через 1-2 дней культуры с питанием пути были явно заблокированы сгустками крови. IVDs являются крупнейшими аваскулярный органов, таким образом, питательные вещества для клеток в НП исключительно зависит от диффузии через капиллярные почек от соседних тел позвонков. Наличие мусора костей и запекшейся крови на концевой пластинки поверхности могут мешать питательных диффузии в центр круга и жизнеспособность компромисс клетки. Наша группа, созданная относительно быстрый протокол для «крэк»-из IVDs из хвоста с низким риском заражения. Мы в состоянии permeabilize свежих вырезать костлявые поверхности концевой пластинки с помощью хирургической системы промывания струей, которая удаляет тромбов и резки мусора и очень эффективно вновь открывается путь питания диффузиик центру IVD. Наличие роста пластин по обе стороны от позвоночного кости, которых следует избегать, и должен быть удален до культуры. В этом видео мы опишем важнейшие шаги в процессе подготовки и демонстрации ключ к успешной органной культуры поддержания высокой жизнеспособности клеток в течение 14 дней в условиях свободного отек культуры. Культуры времени может быть продлен в случае необходимости механической среде может быть обеспечена с помощью механических биореактор нагрузки. Техника показала здесь может быть распространен и на другие виды животных, таких как свиньи, овцы и заячий хвостовой и поясничного IVD изоляции.

протокол

1. Межпозвонковых дисков Уборочная

1. Всего хвост бычий длина получается из местной скотобойни, если это возможно без кожи с наличием кожи повышает вероятность заражения (рис. 2).
2. Подготовка большой доской и подготовки стерильной рабочей станции и инструментов в верхней части разделочную доску (рис. 2).
3. Подготовка под стерильный ламинарный поток капот стерильной марлей смоченной 0,9% натрия хлорида содержащие 55mm цитрат натрия и положить в каждую лунку по 6-луночный планшет.
4. Подготовка бассейна и разводят 1:100 Бетадин раствор с водопроводной водой.
5. Погрузитесь целом бычий хвост в бассейне, содержащем 1% раствор Бетадин в течение 5 мин.
6. Кратко сухой хвост с стерильную марлю и положите его на стерильную рабочую станцию.
7. Осторожно снимите мышцы вокруг хвоста с лезвие скальпеля № 22.
8. Чоп от части хвоста, которые не нужны, как правило, оба конца хвоста, которые содержат относительно большие и очень маленькиеIVDs (рис. 3).
9. Trim дальнейшего мышцы и сухожилия вокруг IVD использованием лезвие скальпеля № 10. Осторожно, чтобы не порезать внешнее кольцо из дисков.
10. Марк передние из IVD с хирургической маркер кожи (этот шаг не является обязательным, оно помогает определить центр осевого вращения в нашей биореактор).
11. Найдите IVD и позвонком точки подключения, перемещая хвост мягко. Почувствуйте, граница между IVD и кости с тупой стороны лезвие скальпеля. Рассекая сайт должен быть на 1-2 мм друг от IVD к позвонка. Место на заказ промышленных держатель лезвие на сайте расщепления (рис. 4).
12. Клив IVD и позвонка ковкой на вершине заказных промышленных держателя лезвия (рис. 3).
13. Повторите с другой стороны IVD-позвонка соединения.
14. Оберните изолированных IVD стерильной марлей смоченной 0,9% натрия хлорида содержащие 55mm цитрата натрия.
15. Продолжить изоляции IVDs на желаемый номер пробы (обычно около 6 можетбыть собраны с диаметром 10-20 мм).
16. Подключите систему струи лаважа (Zimmer, Inc.) С стерильного раствора лактата Рингера, 5л мешки полезной размера (или стерильной PBS или на 0,9% солевого раствора).
17. Держите IVD пинцетом и реактивных промывание обе стороны концевой пластинки поверхности с помощью Zimmer Pulsavac реактивных промывание системы (рис. 1в). Струя ружье должно быть снят на концевой пластинки поверхности под углом от 30 до - 60 ° в течение приблизительно 30 с каждой стороны. (Рис. 1 и 7)
18. Положите IVDs назад к 6-луночного планшета и обертывание с смоченную марлю в то время как струя стиральной другой диск образца.
19. IVDs готовы к органной культуры и вниз по течению приложений (например, жизнеспособность клеток, механические нагрузки, органные культуры) (рис. 1D).

2. Представитель Результаты

Результат измерений судить успешной подготовки межпозвонковых дисков может быть диффузия эксперимент, в котором небольшая молекулярная масса флуоресцентного красителя (например, procion красный)готовят 1% раствор в PBS ^2. IVD затем хранится по меньшей мере 100 мл раствора красителя и красителя затем дают диффузное пассивно в IVD в течение 24 часов в условиях свободного набухания. IVD затем флэш-замораживали в жидком азоте и возвращены до комнатной температуры и обезвоженной рядом ацетон трансфертов (первая предварительно охлаждается в -80 ° С, то -20 ° С, затем 4 ° C и, наконец, до комнатной температуры ). Диск может быть встроен в поли-метил-акрилата (ПММА) и разрезать острым лезвием, чтобы произвести 100 мкм толщиной разделов. Эти секции могут быть просмотрены любым стандартным микроскоп светлого, но преимущественно на использование флуоресцентной микроскопии с procion красный излучает красной флуоресценции (рис. 5-6). Trabeculi костной поверхности появляются очень чистым после шага струи lavaging (рис. 7).

Параметры для успешного органной культуры, прежде всего, отсутствие загрязнения, поддерживать жизнеспособность клеток (рис. 8-9), дисковые высоты иобщий "диск целостности", измеренная с гистологических срезов и сафранина O / прочным зеленым пятном или гематоксилином Майера 3. Мы разработали протоколы и макросы опубликованы в другом месте ^4,5 до пятна живой ткани диска и проверить жизнеспособность клеток в 3D с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и живой / мертвый окрашивания комплект (Molecular Probes, Invitrogen, Базель, Швейцария). Кроме того, мы разработали макро-и рутины для выполнения автоматизированного подсчета клеток для оценки жизнеспособности клеток в ткани 3D или 3D-носителей с использованием платформы NIH ImageJ ^4-6. Альтернативные протоколы были предложены для определения жизнеспособности клеток диска клетки начальными пищеварения использованием последовательного усвоения внеклеточной матрицы с помощью проназы и коллагеназы типа 2, а затем окрасить клеточной суспензии ^7. Ранняя версия протокола участвует инкубации в PBS содержащего в десять раз более концентрированный пенициллина / стрептомицина концентрации в течение 10 минут после уборки дисков до органов у.е.lture. С шагом промывания струей этот шаг устаревает так как этот шаг кажется выгодным для культивирования целей.

Рисунок 1. Обзор методологические шаги по подготовке бычьего копчикового межпозвонковых дисков с неповрежденными концевые и тонким слоем (1-2мм) кости. А) Схематическое изображение межпозвонкового диска (IVD) и его питательной путей. Б) Порядок вырезать IVD с индивидуальным блейд-держатель и промышленных острое лезвие. C) Jet промывание шаг для обеспечения высокой жизнеспособности клеток и дать возможность обмена питательных соответствии концевые и 1-2 мм костной прилагается с обеих сторон. Г) Наконец IVD может быть культурным в образце палаты биореакторе или быть использована для любых вниз по течению приложения.

Рисунок 2 ТОП:. Полная длина свежий коровий хвост (в идеале obtaINED в течение 2-3 часов после вскрытия, чтобы обеспечить высокую жизнеспособность клеток. Внизу: рентгеновское изображение из бычьего хвоста в возрасте около 6 месяцев, иллюстрирующие существование роста пластин (GP), резервный центр окостенения, между костлявыми концевые (EP) и позвонка органов (VB).

Рисунок 3.) Инструменты препарировать бычий хвост в стерильных условиях. Б) Индивидуальные блейд-держатель для выреза двигательного сегмента с бычьим хвостом в действии во время резки межпозвонкового диска. С) Побочные учетом индивидуальных лезвие-держатель с лезвием стандартные промышленные (Lutz, Германия).

Рисунок 4. Рисунок и картина бычьего хвоста после удаления окружающих мышц и связок иллюстрирующие рассекая сайтов вырезать двигательного сегмента. Частичное позвонка должно быть "трещины" Wiм на заказ лезвия держатель идеально 1-2 мм от хрящевых концевые для обеспечения полной поверхности кости.

Рисунок 5. Демонстрация эффективной очистки реактивных промывание шаг до (А) и после (Б). Обратите внимание на чистой поверхности костлявые межпозвоночных сегментов диска после распыления процедуры.

Рисунок 6. Свободной диффузии отек эксперимент свежеприготовленной вырезали бычьего хвоста межпозвонковых дисков (IVDs) оставил в течение 24 часов в 1% procion красный раствор, демонстрируя блокада эффект роста пластины. Цифрового рентгеновского сагиттальной зрения IVD еще содержащий пластины роста и второй слой кости флуоресцентное изображение микроскопии сагиттальной прорезать копчикового бычьего межпозвонковых дисков с эксплантов хрящевые и костные концевой пластинки после 24h свободной диффузии. GP: рост пластины, 2ndry CO: резервный центр окостенения.

Рисунок 7. Свободной отек эксперимент свежеприготовленной вырезали бычьего хвоста межпозвонковых дисков (IVDs) оставил в течение 24 часов в 1% procion красный раствор, демонстрируя эффект очистки реактивных промывание лечения. Сагиттальный толстым слоем (~ 100 мм) вырезали бычьего IVDs с ~ 1,5-mmthick костных пластинок конца, прошедших промывание струей лечения (слева) контрольной стороне без лечения (справа) реактивных промывали лечения. Вход показывает, распыления, которая была использована из системы Zimmer раны хирургическая обработка раны 24 часа свободных экспериментов распространение бычьего межпозвоночного диска эксплантов в 1% procion красный.

Рисунок 8. Live / Мертвые изображений проекций конфокальной стеки Imaging (250 мкм), взятые из Бовинэлектронной межпозвоночных сегментов диска подготовлена ​​с этим реактивным промывание метод держать под свободной отеки при 0 и 14 дней соответственно, для студенистого ядра (NP), внутренний фиброзного кольца (IA) и внешнего фиброзного кольца (ОА). Зеленые клетки = живые клетки окрашиваются кальцеин AM (ацетил метиловый), эритроциты = мертвых ядра клеток, окрашенных по этидия гомодимера-1.

Рисунок 9. Жизнеспособность клеток межпозвонковых дисков с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии на живые ткани и 3D сканирование стека. Жизнеспособность клеток из студенистого ядра (НП) и фиброзного кольца (AF) по 21-дневной культуры в условиях свободного отек состоянии. (Среднее ± стандартная ошибка среднего, N = 6) Статистические различия были протестированы с использованием непараметрических Крускала-Уоллиса подписал теста суммы рангов между группами. Значительные различия были обнаружены между 21-й день и все другие моменты времени в НП. Находясь в AF значимых различий между днем ​​от 7 додень 0. (* Р <0,05, ** р <0,01).

Обсуждение

Первым шагом для успешного органной культуры, чтобы убедиться, что эксплантов не должна быть загрязнена. Хвост должен быть кожей, прежде чем начать с процедуры. Любое животное, волосы привести в стерильной лаборатории, может оказаться проблематичным с точки зрения загрязнения. Бычий х?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
Свежий бычьего межпозвоночных дисков ткани из бычьего хвоста, от местных бойни (в идеале в течение нескольких часов после вскрытия и без кожи).
Pulsavac Plus переменного тока системы	Zimmer вкл., Швейцария	00-5150-486-01	Наилучшая производительность с хип-спрей голову и с источником питания переменного тока (одна с 8 AA аккумуляторов так же работает, но менее удобно)
Высокая производительность вентилятора Spray ж / брызговик, длина 12.7cm	Zimmer вкл., Швейцария	00-5150-175-00	Есть несколько распылительные головки в наличии, мы проверили это один успешно
Скальпель лезвия № 22 и № 10	Сван-Мортна, Англия	# 10: 0201 # 22: 0208
Скальпель держатель лезвия № 3 и № 4	Хаусманн, Германия	# 3: 06.103.00 # 4: 06.104.00
Лутц промышленные лезвия	Лутц, Германия	1022.0884
Фосфатно-солевым буфером (PBS)	Invitrogen, Швейцария	10010-023
Дульбеко изменения Eagle Средняя (DMEM)	Гибко, Швейцария	11960-044
Лактата Рингера раствор (без глюкозы)	Бичсел, Швейцария	133 0002
6-и мульти-луночного планшета	ТЭС, Швейцария	92006
Бетадин раствор	Mundipharma, Швейцария	10055025
Хирургический маркер кожи	Хирургическое Porex, Швейцария	9560
Большая разделочная доска			Любой бренд можно