Генетических манипуляций мозжечка Granule нейронов<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; По изучению нейронных Морфология и миграция

Резюме

Нейронов морфогенез и миграция являются важными события, лежащие в основе правильного развития мозга. Здесь мы описываем методы, чтобы генетически манипулировать культивируемые мозжечка гранул нейронов и развивающийся мозжечок для оценки морфологии и миграционных характеристик нейронов.

Аннотация

Развивающие события в мозге в том числе нейронов формообразования и миграции высоко организованы процессы. В пробирке и в естественных анализирует позволяют для характеризации углубленного выявления путей, вовлеченных в эти события. Мозжечка гранул нейроны (КСГН), которые получены из развивающихся мозжечка являются идеальной моделью системы, которая позволяет морфологического анализа. Здесь мы опишем метод того, как генетически манипулировать КСГН и как учиться axono-и dendritogenesis отдельных нейронов. С помощью этого метода эффекты интерференции РНК, повышенной экспрессией или малых молекул может быть по сравнению с контрольными нейронов. Кроме того, грызун коры мозжечка является доступным в системе естественных условиях в связи с его преимущественным развитием послеродовой. Мы также представляем естественных условиях технику электропорации в генетически манипулировать развивающийся мозжечка и описать последующую мозжечка анализирует оценить нейронов морфологии Aй миграции.

Введение

Мозжечок является отличной системой для изучения механизмов роста аксона и миграции. Мозжечок является предметом анатомических исследований с незапамятных неврологии ^1. Современная микроскопия и иммуногистохимические методы значительно расширили и уточнили первоначальные открытия, Сантьяго, Рамон, и Cajal ^2-4. Генетика мыши и молекулярные исследования обнаружили существенный рост и транскрипционных факторов в контроле развития мозжечка, что привело к большему пониманию важнейших событий, необходимых для правильного подключения различных типов нейронов в том числе мозжечка гранул нейронов (КСГН) ^5-7.

Мозжечок является производным ромбомере 1 развивающегося заднего мозга ^8. Ромбическая губа, которая является частью крыши ^4-го желудочка, приводит к мозжечка гранул нейронных клеток-предшественников, которые будут составлять самую многочисленную нейронов населения ввзрослых мозжечок ^9. После ростральной миграции, они располагаются в коре зачатка. Здесь, митоз гранула нейронных предшественников приводит к резкому расширению внешнего зернистого слоя (EGL), который проходит после рождения у грызунов. Из EGL, нейроны начинают мигрировать внутрь через молекулярного слоя (ML), мимо слой клеток Пуркинье в конечном итоге поселяются во внутреннем зернистого слоя (IGL ^2). Во время этого миграционного процесса, они приобретают биполярную форму с двумя аксоны, проходящий в ML. После дальнейшей миграции, тело клетки мигрируют от аксонов и эти два процесса сливаются, образуя один раздвоенный, Т-образные аксон ^10. Впоследствии эти аксоны расположенный пучком и называются параллельными волокнами. Поселившись в IGL, КСГН расти дендриты, которые образуют дендритные когти установить синапсы с мшистых волокон. Чтобы исследовать фундаментальные процессы в развивающемся мозжечке, объединены в пробирке и в естественных условиях approacч позволяет надежных результатов и выводов.

КСГН не только самые многочисленные нейроны мозжечка, но из всей мозга и может быть культурным в высокой степени чистоты ^11-13. В культуре, однако это весьма однородной нейронов население становится быстро постмитотическими и приобретает полярный морфологию с легко идентифицируемых аксонов и дендритов. Искусственный КСГН оказались чрезвычайно полезными для изучения различных аспектов развития нейронов включая пролиферацию предшественников, дифференциации аксонов и дендритов развития, миграции нейронов, апоптоз и электрофизиологических свойств ^(14-19 и многие другие). Использование генетических манипуляций расширила универсальность культивируемых КСГН и позволил для дальнейшего механистического понимания вышеупомянутых событий. Трансфекция культивируемых нейронов использованием низким кпд фосфат кальция или липофильные методы следуют иммуноцитохимии с полярностью маркеров или программного обеспечения при поддержке анализа FaciliTates оценку например морфологии отдельных нейронов в плотной нейронов культуры. При таком подходе роль представляющих интерес белков в аксонов или дендритов роста могут быть изучены ^20-25,26-28. Эта система культуры, однако, менее полезны для анализа миграцию нейронов, как миграция очень ограничена в культурах с высокой плотностью и потребует совместных культурах. Анализ в пробирке аксона и роста дендритов также позволяет рассмотрении взаимосвязанных белков сигнального пути с использованием комбинации РНК-интерференция (I), сверхэкспрессии или малых молекул.

Для установления актуальность интересующего белка в аксона и регуляции роста дендритов или миграции нейронов, электропорации в естественных условиях (IVE) метод позволяет для анализа в развивающихся коры мозжечка. Благодаря тому, что мозжечковая развитие у грызунов проходит путь в первых двух недель постнатального, мозжечок представляет собой accessibструктура мозга ле для генетических манипуляций с целью рассмотрения развития аксонов и дендритов, миграцию нейронов, синаптогенез и апоптоз ^{20-24,29,30,26,27,31-34.} Кроме того, эта модель системы также полезно для других аспектов развития нейронов, которые требуют неповрежденную коры мозжечка например аксона поиска пути, проводки и подключения нейронов и нейронов-глии взаимодействий, вместе взятых, этот протокол обеспечивает в пробирке и в естественных условиях методы для решения дополнительный подход в отношении нейронов формообразования и миграции.

протокол

КСГН могут быть получены либо из послеродовой день (P) 5 щенков мыши или P6 крысят. Мы следуем протокол, описанный Bilimoria и коллег, в которой используется ингибитор митоза, чтобы выбрать для постмитотических КСГН ^13.

Этика заявление:
Все эксперименты с живых животных были проведены в соответствии с протоколом животных, утвержденной "Verbraucherschutz унд Lebensmittelsicherheit" Нижней Саксонии, Германия.

В пробирке анализа:

1. Подготовка ДНК плазмиды, СМИ, и буферов для фосфата кальция трансфекции Method

1. Растворите ДНК плазмиды в стерильной, эндотоксинов воде; DMEM (с высоким содержанием глюкозы); сделать 2,5 М CaCl _2; сделать 2x ССРХ (растворить 4 г NaCl, 0,1775 г KCl, 0,095 г Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O, 0,675 г глюкозы и 2,5 г HEPES в 250 мл воды высокой степени очистки и доведения рН до 7,05, 7,08 и 7,11). Примечание: При подготовкерешение 2x ССРХ, тест, рН дает лучшие результаты в отношении эффективности трансфекции данной комбинации плазмид.

2. Трансфекция культивируемых нейронов

Рисунок 1. Блок-схема аксона в пробирке и дендритов анализе роста. Искусственный КСГН (24-луночный планшет с покровные стекла), изолированный от P6 крысят, трансфицируют в DIV 0 или 1 с осадка ДНК, содержащего флуоресцентный маркер трансфекции (например, GFP). После фиксации и иммуноцитохимии, нейроны изображаются слепым методом. Изображения импортируются в ImageJ и процессы измеряются. Измерения затем обрабатываются с использованием статистической программы.

1. Семенной КСГН (20 х 10 ⁶ на 24-луночный планшет; BME, 10% сыворотки теленка, 2 мМ пенициллин-Streptomycin-глютамин (PSG), 25 мМ KCl) на азотной кислоты промывают, полиорнитин покрытием 12 мм покровные стекла в 24-луночный планшет с 500 мкл среды на лунку.
2. В день в пробирке (DIV) 0 (по крайней мере 8 часов после нанесения покрытия) или DIV 1, собирать средства массовой роста и держать при температуре 37 ° С. Промыть нейроны дважды 500 мкл DMEM нагретого и добавить 500 мкл DMEM.
3. Место нейроны в инкубаторе (37 ° C, 5% CO ₂₎ в течение 45 мин.
4. Подготовка 40 мкл осадка ДНК для каждой скважины путем смешивания: ДНК (2-2,5 мкг / лунку, 10% от общего ДНК должна быть трансфекции маркер например GFP визуализировать трансфицированными нейроны), вода (до 18 мкл), добавить 2 мкл 2,5 М CaCl _2, хорошо перемешать и добавить 20 мкл 2х HBSS.
   1. Инкубировать осадок ДНК в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. Добавить осадок ДНК в каждую лунку и инкубировать нейроны в течение 18 минут в инкубаторе.
6. Удаление смесь DMEM / ДНК и мыть нейроны дважды 500 мкл нагретого DMЕ.М..
7. Добавить собранную СМИ, начиная с шага 2.2 обратно в нейронах. Если нейроны будут в культуре в течение более 3 дней, Дополнение СМИ с 25 мМ глюкозы в DIV 3 пополнить источник углерода.
8. После 1-5 дней, при условии нейроны в иммуноцитохимии помощью GFP антител.
9. Изображение не менее 30 отдельные нейроны в состоянии в слепым методом с использованием флуоресцентного микроскопа.

3. Измерьте аксонов и дендритов с NeuronJ, в NIH ImageJ Plugin

Важно: Убедитесь, что изображения масштабируются correctluy с помощью соответствующего пикселя: соотношение мкм в зависимости от увеличения и разрешения изображения.

1. Преобразование изображения в 8-битных с ImageJ: Открытое изображение, выберите «образ» -> «тип» -> '8 немного '->' изображение Save '.
2. Запустите NeuronJ плагин и открыть 8-битное изображение.
   
3. Используйте опцию "Добавить обводка" для отслеживания аксон: CLИк левую кнопку мыши один раз в начале аксона и переместите мышь вдоль процесса. Дважды щелкните на кончике аксона, если след соответствует аксонов форму.
   
   Примечание: В случае, если предложил след отличаться от аксонов форме, один раз нажать на аксонов процесса на якорь след, затем дважды щелкните на кончике аксона.
4. Нажмите на "Мера начертаний", выбрать "Показать трассировки измерения" пункт и нажмите "Выполнить". Измерения Axon все отображается в новом окне. Для дендритов, выбрать 'измерений Группа индикации опцию' и нажмите 'Run'.
   
   Всего дендритные измерения все отображается в новом окне. Сохранить их в виде отдельного файла, который можно открыть в любой программе электронных таблиц.
5. В качестве альтернативы для ручной трассировки, использовать программное обеспечение Фиджи: Щелкните правой кнопкой мыши на гоэ опция 'Прямая линия', выберите 'Freehand линию »,
   
   держать левую кнопку мыши и вручную отследить процесс, нажмите 'Ctrl + M "для измерения.
6. Рассчитать среднюю аксонов / дендритных длину для одного состоянии и использовать соответствующий статистический тест.
   
   В естественных условиях электропорации:

1. Оборудование и Подготовка реагентов

1. Вам нужно 30 г иглы, прокладку (1-2 мм), шприц, мертвый объем редуктор (DVR), электропоратора и tweezertrodes, грелку или инфракрасного тепла лампы, гусиная шея лампу и изофлуран.
2. Положите DVR в иглу, затем прикрепить иглу в шприц, и, наконец, положить прокладку на иглу (рис. 2).
   
   Фигура2. Подготовка иглы. DVR отрезан пипетки 200 мкл и помещают в иглу, чтобы уменьшить мертвое пространство. Spacer получают из 200 мкл наливного наконечника с и помещают на конце иглы, чтобы регулировать глубину проникновения в мозжечке до приблизительно 2 мм. Единиц измерения: см
3. Растворите ДНК в PBS/0.03% Быстрый зеленый. Примечание: В трансфекции маркера, выгодно использовать флуоресцентный белок, который находится под нейрона-специфического промотора (например, Synapsin) визуализировать только нейроны. 25% от общего количества плазмидной должно быть плазмидой, кодирующей трансфекции маркер.
4. Сделать 70% этанола.
5. Смешайте равные объемы октября и 30% сахарозы, растворенного в PBS.
6. Заполните шприц с 4 мкл ДНК (4 мкг / мкл плазмидной ДНК в PBS/0.03% Быстрый зеленый).

2. IVE крысят

Блок-схема IVE: см. рисунок 3

Рисунок 3. Блок-схема в естественных условиях электропорации. Щенков P4 крыс анестезируют изофлураном и плазмидной ДНК, кодирующей флуоресцентный маркер трансфекции (например, GFP) вводят в мозжечке, с последующим воздействием электрических импульсов 5. Пять дней спустя, изолированных GFP-положительных мозжечка подразделяются и подвергали иммуногистохимии. Изображения получены с помощью конфокальной микроскопии и проанализированы с помощью программного обеспечения Imaris. Данные обрабатываются с статистической программы.

1. Используйте P4 крысят из альбиноса деформации (Вистар или Long Evans).
2. не Обезболить щенков (один за другим) изофлураном в небольшой коробке (например P1000 пипетки коробка) с 200 мкл изофлураном (смоченной в ткани) в течение 1-2 мин, пока щенок больше не движется. Позаботьтесь о том, щенки не попасть в контакте соIth Iiquid изофлурана. Монитор время близко, насколько отдельные щенки-разному реагируют на наркоз.
3. Стерилизовать затылок щенка с 70% этанола.
4. Fix глава щенка между большим и указательным пальцами и использовать гусиная шея лампу, чтобы найти мозжечка альбиноса щенка. Поперечный синус резко разграничивает средний мозг (верхняя и нижняя бугорок) от корковых полушарий (рис. 3). Мозжечок находится рядом с мозга и появляется в более темный оттенок. Используйте несмываемый маркер для обозначения мозжечок с точкой. Важно: Держите щенка в фиксированном положении! Примечание: Если анестезия стираться во время этой процедуры, подвергать щенка изофлураном до инъекционных ДНК.
5. Вставьте иглу (рис. 3) и медленно вдохнуть 3 мкл ДНК в мозжечке.
6. Пусть решение ДНК диффузного течение 30-60 сек.
   1. Поместите голову щенка между tweezertrodes так, чтобы отрицательный полюс вступает в контакт с задней части головы (мозжечкаг область) и, что плюс полюсные контакты в противоположную стенку голову (рис. 3).
   2. Тема щенок до 5 электрических импульсов. Регулировка напряжения на вес детенышей, чтобы обеспечить хорошую эффективность электропорации без ущерба их выживание (табл. 1).

      Вес	Напряжение	Импульс	Интервал
      8-9 г	160 В	50 мс	950 мс
      9-10 г	165 В	50 мс	950 мс
      > 10 г	170 В	50 мс	950 мс

      Таблица 1. Электропорация P4 крысят.
   3. Пусть щенки восстановить на нагретой панели или под инфракрасной лампой. Вернуться щенков в Дам. Важно: Убедитесь, что источник нагрева не наносит никаких ожогов.
7. Жертвоприношение щенков через 5 дней после электропорации, помещая их в СО ₂ с последующим обезглавливания.
   1. Изолировать мозжечка и экран для GFP-положительных мозжечка с помощью флуоресцентного микроскопа.
8. Исправить мозжечка в 4% PFA O / N при 4 ° С, а затем инкубируют в 30% сахарозы при 4 ° С до мозжечка раковиной в нижней части трубки.
9. Вставить мозжечка в OCT/30% сахарозы и сократить 40 мкм корональные разделы, используя криостат. Примечание: Раздел каждый мозжечок в слепым методом.
10. Тематические секции для иммуногистохимии с использованием GFP антитела. Контрастирующая с ядерным красителем (DAPI или Hoechst 33258) и определить локализацию не менее 200 трансфектированных нейронов на одно животное.
11. Для углубленного анализа, разделить IGL пополам, в результате чего в верхней IGL обращенной к ОД и более низкую IGL с видом на белое вещество и считать GFP-положительных нейронов, проживающих в каждом из таймов. Примечание: графа GFP-положительных нейронов каждого раздела слепым методом.

3. Измерение дендритов Длина, Приобретать Изображения Секции по х, у, г Plane Использование конфокальной микроскопии

Примечание: например, использовать 40 изображений на разделе с г-stwp 1 мкм 40 мкм.

1. Открыть серии изображений в программном обеспечении, Imaris, для создания 3D-изображение дендритов.
2. Нажмите на режиме "Превзойти ', чтобы посмотреть нейрон в 3D.
   
3. Выберите "Добавить новый нить" и нажмите "Перейти автоматическое создание", чтобы начать полуавтоматической трассировки.
   
   Примечание: Анализ каждого 3D-изображения в слепым методом
4. Выберите вкладку "Ничья" и "Автодорожка '.
   
5. Наведите курсор мыши на слокоть тело и Shift + Щелчок правой кнопкой мыши, чтобы выбрать тело клетки. Примечание: Autocalculation программным обеспечением может потребоваться несколько минут.
   
6. Добавить пути к нити (дендритов) с помощью Shift + Щелчок левой кнопкой мыши. Примечание: Пути могут быть визуализированы в реальном времени.
   
7. Перейдите в окно статистики накаливания и нажмите на кнопку "детальной», «конкретные значения» и «нитей длиной дендритов (сумма)» для суммы общей протяженностью дендритов.
   
8. Используйте соответствующие статистические тесты для анализа данных.

Результаты

Для анализа морфологии КСГН в ответ на различных условиях культивирования, мы трансфицировали нейроны на DIV 0, как описано выше. После трансфекции мы поместили один набор нейронов в полный среды (BME, 10% телячьей сыворотки, 2 мМ PSG, 25 мМ KCl) и другой набор в минимальной среде, содержащей инсул?...

Обсуждение

Преимущества и ограничения описаны в пробирке и в естественных условиях методов:

Искусственный КСГН от мыши и крысы одинаково хорошо подходит для морфологического анализа. В связи с большим размером мозжечка крыс, выход АГНКС от крысят превышает щенков мыши 3-...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11960-044
BME	Gibco	41010-026
Insulin	Sigma-Aldrich	Si-1-4011
Poly-L-Ornithine	Sigma-Aldrich	P-2533
CaCl2	Appli-Chem	A3652
Isoflurane	Actavis Deutschland
Tissue-Tek OCT	Sakura
ECM 830 and tweezertrodes	Harvard Apparatus
Epifluorescence microscope and camera	Nikon
SP2 confocal microscope	Leica
ImageJ	NIH
Imaris 7.4.2	Bitplane, Inc.
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc.
MS Excel	Microsoft
Loading tip 1-200 µl	Costar	4853
Pipette tip 200 µl	Sarstedt	70.760.502
Microlance 3 needle, 30 G	BD	302200
50 µl gastight Syringe 1705	Hamilton
Glass coverslips	Thermo Scientific Menzel Glaeser	CB00120RA1