Используя технологию 3D печати для слияния с МРТ гистологии: Протокол для мозга Секционирование

Резюме

Общей целью данного протокола является точное выравнивание магнитно-резонансная томография (МРТ) объемы изображений с помощью разделов гистологии создания заказных 3D печатных носителей мозга и коробки среза.

Аннотация

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.

Введение

In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.¹ While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. ^{2, 3} To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.

However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.⁴ Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a "needle-in-a-haystack" scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.

Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.^{5, 6, 7, 8} The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.⁴ On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.⁹

The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.

Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human¹⁰ and marmoset brains.⁴ The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with "human" will denote differences in protocol specific to the human brain.

протокол

Вся обработка и процедуры, описанные здесь животных были проведены в соответствии с протоколом, утвержденным Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта уходу и использованию животных комитета. Мозги были собраны из общих мартышек (Callithrix jacchus) , индуцированный развивать EAE. ¹¹ Мозги хранили в 10% формалине в течение от 3 -х недель и через год после эвтаназии путем transcardial перфузию 4% параформальдегидом.

1. Патологоанатомическое МРТ Подготовка и приобретение

1. Мартышка мозга
   1. Подготовьте рабочее место с хлопковой марли, 50 мл центрифужную пробирку, небольшие шпатели, ~ 30 мл фторированной масла, парафин и игрунки мозг.
   2. Заполните трубку с фторированным маслом и марли до отметки 20 мл. Сжать марлю, чтобы удалить пузырьки воздуха вдоль пути.
   3. Аккуратно сухой формалина с поверхности мозга с бумажным полотенцем. Вставьте мозг с лобного полюса по направлению к нижней частитрубка. Тщательно закрепите мозг в пробирке, используя больше марлю вокруг сторон, чтобы зафиксировать свою позицию. Обратитесь к дополнительной секции 11 для способа создания люльку МРТ головного мозга для установки дополнительных МРТ.
   4. Заполните остальную часть трубки с марлей и фторированные масла. Осторожно удалить пузырьки воздуха вдоль пути. Закрепите крышку и запечатать трубу с парафином.
   5. Отметьте колпачок в соответствии с межполушарной борозды. Оберните трубку в бумажное полотенце и вставить его в катушку с меткой топ-центра.
   6. Приобретать 2D спиновое эхо T2. Параметры приведены в таблице 1.
   7. Открыть 10 анатомических 150 мкм Т2-weigted приобретения в Mipav и зарегистрировать на приобретение 6 - ^й.
      Примечание: регистрация представляет собой оптимизированный алгоритм автоматической регистрации 3.5D с 9 степенями свободы, оконного синк интерполяции, нормированной взаимной корреляционной функции затрат, с вызовом алгоритма Выберите Пауэлла Брента. Повороты были отобраны от +106; до -10 ° с грубыми вращениями приращением 5 градусов и тонких вращений приращением 1 °. Тогда в среднем зарегистрированных изображений: утилиты, изображения калькулятор-Bulk изображения, среднее.
2. Человеческий мозг
   1. Отделить переднего мозга от ствола мозга с помощью разреза на уровне среднего мозга. ¹⁰ Полушария также могут быть разделены с разрезом вниз по средней линии.
   2. Поместите передний мозг в цилиндрической трубке с полусферическим куполом на одном конце и носик на другом конце.
   3. Заполните трубку с фторированной масла через носик. Удалить пузырьки воздуха с помощью деликатного всасывания в течение ~ 30 мин через носик.
   4. Приобретать 3D T1-MPRAGE. Параметры приведены в таблице 1.

2. Извлечение мозга Поверхность: Mipav 7.2

1. Откройте МРТ в корональной ориентации.
2. Выберите алгоритмы, преобразование инструментов, Transform, Resample. Выберите пользователя определенный размер и ресэмплировать к ISOTropic вокселей: 0,1 х 0,1 х 0,1 мм. Сохранить МРТ как повторную выборку Brain_MRI_Resampled. Человек: Resample изотропного вокселей 0,3 х 0,3 х 0,3 мм.
3. Выберите алгоритмы, фильтры (пространственное), нелинейное снижение уровня шума. Используйте настройки по умолчанию, нажмите на кнопку OK.
4. Выберите Отображает таблицу поиска и нажмите на кнопку порога двойной. Перетащите ползунок на графике, чтобы покрыть весь мозг.
5. Выберите Алгоритмы, сегментация, пороговое значение, пороговое значение с помощью мин / макс. Введите значение, расположенную в нижнем левом углу графика интенсивности (чуть ниже шкалы) в поле "Нижний предел". Выберите "двоичный" в для типа выходного изображения и снимите флажок "инвертировать порог".
6. Выберите Алгоритмы, морфологический, Заполните отверстия. Проверка "процесса в 2.5D."
7. Так как это МРТ полного мозга, есть некоторое пустое пространство между задним мозгом и корой, которая должна быть заполнена. Человеческий мозг: пропустить этот шаг.
   1. Используя линию VOI, рисовать в связимежду задним мозгом и корой с обеих сторон мозга на самой боковой точки. Продолжить это через мозг.
   2. Выберите преобразование ВОИ, VOI, все в двоичную маску. Выберите Служебные программы, калькулятор изображения. Выберите или из выпадающего меню оператора и выберите маску мозга. Выберите "Стимулирование назначения типа изображения"
   3. Выберите Алгоритмы, морфологический, Заполните отверстия. Проверка "Процесс в 2.5D"
8. Сохраните двоичную маску как Brain_Model.nii.
9. Выбор алгоритмов извлечения поверхности (марширующие кубы). Выберите изображение маски, Сохранить как Brain_Model.ply.

3. Выбор Slice География: Mipav 7.2

1. Определить интересующую ткань или исходное положение. Вычислить предполагаемую толщину плиты. В мартышка мозга, считая 30 МРТ срезов в каждой секции, и 5 МРТ ломтиков в зазор лезвий, создает 3 секции мм с зазорами лопастей 0,5 мм, в результате чего в ~ 3,5 мм плит. Человеческий мозг: 20 МРТ срезов в секции, и 4 МРТ слльды в зазор лезвий, создает 6 секций мм с зазорами лопастей 1,2 мм, что приводит к ~ 7.2 мм плит.
2. На месте первого зазора лезвия, нажмите на "коробке ВОИ", а затем нарисовать прямоугольник над мозгом. Нажмите внутри окна, чтобы выбрать его. Скопируйте и вставьте контур для каждого среза МРТ соответствующего зазора лезвия.
3. Пропустить вперед по количеству срезов MRI, соответствующей толщине секции и скопировать и вставить контур, соответствующий следующему щелью лезвиями. Повторите этот процесс через мозг.
4. Выберите VOI, VOI Конверсия, все для Binary маски. Сохранить как Blade_Gaps.nii.
5. Выбор алгоритмов извлечения поверхности (марширующие кубов), маска изображения, Blade_Gaps.ply.

4. Создание МРТ лезвия Карта: Mipav 7.2

1. Откройте Brain_MRI_Resampled и Blade_Gaps.nii изображения.
2. С Blade_Gaps.nii выбранного изображения, выберите Утилиты, Image Math. Выберите Содействие тип изображения и умножать.Введите 10000 в качестве значения.
3. Выберите Утилиты, Калькулятор изображения. Выберите Добавить, а затем выберите Brain_MRI_Resampled изображение из окна изображения в раскрывающемся меню. Выберите Стимулирование назначения типа изображения.
4. Сохранить это изображение как Brain_BladeMap.nii.
5. При нажатии на представлении Triplanar, места, где будут нарезанных мозг можно рассматривать в трех ортогональных взглядов.

5. Импорт мозга и отвал Gap поверхности: Netfabb Professional

1. Выберите часть, добавить часть. Выберите файлы Brain_Model.ply и Blade_Gaps.ply
2. Выберите мозг и нажмите на режиме восстановления. В режиме ремонтных работ:
   1. Нажмите на кнопку выбора оболочки, а затем нажмите на мозг.
   2. Нажмите на кнопку выбора переключения для выбора других сетках. Нажмите на кнопку Удалить для удаления других сетках.
   3. Нажмите на кнопку Применить Ремонт и удалить старую часть.
3. Щелкните правой кнопкой мыши на мозг. Выберите шаг. Нажать наДля кнопки происхождения. Запишите параметры XYZ, которые появляются. Эти параметры перевода необходимы для поддержания полотна пилы, установленный в Mipav. Нажмите на Перевести. Затем закройте окно. (Не нажимайте кнопку перевода более чем один раз. Это будет переводить еще раз, используя одни и те же параметры.)
4. Выберите модель Blade_Gaps. Щелкните правой кнопкой мыши на части и выберите команду Переместить. Введите значения XYZ, записанные ранее в параметрах коробки XYZ. Теперь нажмите кнопку Перевести и закройте окно.
5. Выберите модель Brain_Model и нажмите на режим ремонта. В режиме ремонтных работ:
   1. Нажмите на кнопку выбора оболочки, а затем нажмите на мозг.
   2. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите Smooth Треугольники. Введите 4-5 итераций. Проверьте Предотвращение громкости усадку. Человеческого мозга: 1-2 итераций.
   3. Щелкните правой кнопкой мыши, выберите Уменьшить Треугольники. Введите 200000 подсчета целевого треугольника и нажмите кнопку Выполнить.
   4. Нажмите на автоматическое восстановление, ремонт по умолчанию. Затем нажмите на кнопку Применить Ремонт
6. Щелкните правой кнопкой мыши, Переименовать. Переименовать сглаженный мозг как Smoothed_Brain_Model.
7. Выберите Smoothed_Brain_Model. Щелкните правой кнопкой мыши, Экспорт, STL.

6. Редактирование мозга Контуры: Meshmixer

1. Импорт Smoothed_Brain_Model в Meshmixer.
2. С помощью лепки и выбора инструментов, чтобы внести изменения в сетке. Изменения включают в себя:
   1. Используйте Скулптинг инструменты, Robust гладкие. Гладкая область, соответствующую линии Войс. Человеческий мозг: пропустить этот шаг.
   2. Гладкая поверхность коры, которая будет лицевой стороной вниз в поле.
   3. Сгладит небольшие дерн, которые могли быть созданы в процессе переплетения и редактирования.
3. Выберите Analysis, инспектор, авторемонтных все.
4. Экспорт Smoothed_Brain_Model в Smoothed_Edited_Brain_Model.

7. Создание мозга Slicer Box: Netfabb Professional

1. Выберите часть, Добавить деталь. Выберите филе Smoothed_Edited_Brain_Model.
2. Выберите часть, Добавить деталь. Затем выберите файл STL мозга Тесак Parts_Marmoset и нажмите кнопку Открыть. Человеческого мозга: Мозг Тесак Parts_Human (Дополнительные файлы кода).
3. Щелкните правой кнопкой мыши на части и выберите Extended, Раковины на части. Выберите каждую часть по отдельности и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы переименовать их. ( При нажатии на глаз рядом с объектом , скрывает его или делает его видимым.) Переименовать большую коробку Main, небольшой блок Sub, а также ящик для резки Box_Cutout, шестиугольника форма Blade_Holder_Main, небольшой плоский ящик микротомных клинка, и половинным трубка объект Колыбель. Человеческий мозг: нет Blade_Holder_Main, микротомных клинка или Колыбель.
4. Скрыть Main, Sub, Blade, Blade_Holder_Main, Микротом Blade, и Cradle и использовать Shift-выберите , чтобы выбрать все шесть и Box_Cutout. Только Box_Cutout и Smoothed_Edited_Brain_Model должен быть виден, но Smoothed_Edited_Brain_Model не следует выбирать.
5. Нажмите и перетащите выбранные части для регулировки положения окна по отношению к мозгу.
   1. Поместите мозг в центре коробки. Постион мозг достаточно глубоко в коробке, чтобы быть плотно схватился, но не слишком глубоко, чтобы создать свесы, которые мешают надлежащего размещения.
6. После того, как позиционируется, блок мозга контур может быть проверен на свесами. Выберите Box_Cutout и Smoothed_Edited_Brain_Model. Выберите логические операции.
   1. Нажмите на Smoothed_Edited_Brain_Model , чтобы превратить его в красный цвет.
   2. Выберите Boolean вычитанием, и применить расчеты.
7. Установите флажок для мозга свесами, что бы предотвратить мозговую ткань от быть безопасно помещен в коробку. Если эти выступы присутствуют, отрегулируйте мозг, так что менее глубоко внутри коробки. Если мозг на нужную глубину и свесамиприсутствуют, обратитесь к дополнительному разделу 10 для раствора для удаления свесов.
8. Выберите модель Blade_Gaps. Щелкните правой кнопкой мыши, выберите Переместить. Запишите значение позиции Z, затем закройте окно. Это будет положение разрыва наиболее задней лопатки.
9. Выберите лезвие STL, прилагаемую из мозга SLICER частей. Щелкните правой кнопкой мыши, выберите Переместить.
   1. Выберите Absolute перевод. Введите значение Z от 7.8. Для значений X и Y, введите соответствующее значение из текущих полей параметров позиции
10. Выберите лезвие STL. Щелкните правой кнопкой мыши, выберите пункт Дублировать.
    1. Проверьте Устройте части. Введите общее количество лопастей в общем количестве. Введите тот же номер в поле счетчика Z. Введите толщину плиты в Z зазор. Нажмите на дубликате. Если толщина плиты варьировали, лопасти должны быть расположены в индивидуальном порядке. Повторяющиеся каждое новое лезвие от предыдущего (переход от задней к передней)с г зазором, равным толщине раздела для этого раздела.
11. Расположите части микротомных лезвие точно такими же интервалами , как лопасти в ломтерезки, повторив шаг 7.9 и 7.10 для микротомных Blade. Человеческий мозг: пропустить этот шаг.
    1. Выберите Микротом отвал вместе с частью Blade_Holder_Main и выберите логические операции.
    2. Выберите все лезвия микротома лезвие , чтобы выделить их красным цветом. Нажмите на булевой вычитанием, и применить расчеты.
    3. Выберите режим ремонта. Выполнение расширенного ремонта. Выберите применить ремонт и удалить старую часть.
    4. Переименовать часть лезвия держатель. Экспорт часть как STL.
12. Shift-выберите Smoothed_Edited_Brain_Model, все модели сверхтонких , созданных на предыдущем шаге, а второй и основной. Нажмите на булевой операции.
    1. Сделайте все детали , кроме главного красного С.Е.сборном их и нажав на стрелку под зеленое поле, чтобы переместить их в красный цвет.
    2. Выберите Boolean Вычитание, а затем выберите применить расчеты.
13. Нажмите на ремонтном режиме. В режиме ремонтных работ:
    1. Установите флажок для свесами и острых моментов. Они могут быть сглажены в Netfabb или Meshmixer.
    2. Нажмите Автоматический ремонт, расширенное восстановление. Затем нанесите ремонт и удалить старую часть
14. Щелкните правой кнопкой мыши на поле отремонтированного мозга и переименовать его мозга Тесак Box. Экспорт как STL.

8. Печать мозга Slicer Box на Ultimaker 2

1. Мартышка Мозг: Cura
   1. Импорт мозга Slicer Box в Курой.
   2. Выберите Поворот и перетащить круг, чтобы вращать коробку, так что квартира на кровати.
   3. Настройте параметры печати: разрешения слоя 0,1 мм, 50% плотности заполнения, плоту.
   4. Выберите Сохранить Инструмент Путь к SD-карте. (Время печати ~ 12 ч.)
   5. Импорт в держатель лезвиячтобы Курой и повернуть его так, прорези по бокам и шестиугольник лицо в XZ или плоскости YZ.
   6. Дублирование объекта.
   7. Настройте параметры печати: разрешения слоя 0,2 мм, 20% плотности заполнения, доверху.
   8. Выберите Сохранить Инструмент Путь к SD-карте. (Время печати ~ 3 ч)
2. Человеческий мозг: Cura
   1. Импорт мозга Slicer Box в Курой и вращаются как в 8.1.2.
   2. Настройте параметры печати: разрешение .2 мм слоя, 30-35% плотность заполнения, плоты.
   3. Выберите путь для сохранения инструмента на SD-карте. (Время печати ~ 70 ч для одного ящика полусферы.)
3. На Ultimaker 2
   1. Нанесите тонкий слой клея палку клея, чтобы построить пластину.
   2. Вставьте SD-карту. Выберите печать и выбрать часть.

9. Сокращение мозга

1. Мартышка мозга
   1. Подготовьте рабочее место с фиксированным мозгом, резателя мозга, два держателя лезвий, микротомных лопатками, 1 мл фторированной масла, FLAT пинцеты, защитные перчатки, и встраивание кассеты.
   2. Поместите новые лезвия микротома в пазы держателей лезвий. Убедитесь, что скошенный край каждой лопасти обращена в том же направлении. Надевайте защитные перчатки при работе с микротомных лезвий.
   3. Удалить мозг от формалина и осторожно высушить его.
   4. Поместите мозг в резателя. Несколько капель масла фторированной могут быть применены к мозгу и ломтерезки, что обеспечивает удобство позиционирования. Убедитесь в том, что мозг твердо на месте.
   5. Установите держатели ножей с лезвиями в соответствующие пазы лопаток.
   6. Надавите на держатели лопастей надежно и применять медленное давление баланс, чтобы сократить через мозг.
   7. Удалите каждую плиту, по одному за раз, начиная с передней части мозга. Это помогает удалить микротома лезвие перед плитой перед удалением самой плиты. Обратите особое внимание на передней / задней ориентации каждой плиты.
   8. Сфотографируйте передней апd задней поверхности каждой плиты. Задние плиты, скорее всего, содержат отдельные части, поэтому обратите внимание на ориентацию деталей для встраивания. Поместите каждую плиту в вложению кассету и поместить их всех в 10% раствор формалина.
2. Человеческий мозг
   1. Тщательно проверить подгонку мозга в коробке.
   2. Нарезать мозг, начиная с одного конца, используя наклонную разрез, медленно, но твердо нарезка. Вырезать мозг через каждый зазор лезвия.
   3. Удалите каждую плиту по одному за раз, обращая особое внимание на количество и передней / задней ориентации каждой плиты.
   4. Сфотографируйте передней и задней поверхности каждой плиты. Поместите плитки в запечатанных 10% формалине мешки. Тканевые блоки будут вырезаны из плит и помещают в кассеты для встраивания.

10. Удаление Заходы в головном мозге Box (Дополнительный раздел)

1. Вытащив ломтиков: Meshmixer
   1. Импорт Smoothed_Edited_Brain_Model.
   2. Выберите Edit, Сделайте ломтиками. В Make ломтиков:
      1. Выберите штабелях 3D, Z, введите толщину 1-2 мм. Нажмите Compute. Когда кусочки загрузки нажмите Принять.
   3. Выберите 1 или 2 кусочка с большими периметров вблизи нижней части коры. Эти кусочки должны быть ниже уровня коробки Sub.
   4. Экспорт каждой из этих срезов как Brain_Slice_ #.
2. Расширение ломтиков до удаления свесов: Netfabb Professional
   1. Импорт Brain_Slice_ # ломтиков.
   2. Повторяющиеся каждый Brain_Slice_ # (снимите флажок расположить детали при проверке).
   3. Щелкните правой кнопкой мыши на одной копии каждого Brain_Slice_ # и выберите Scale.
      1. Снимите флажок Фиксированный коэффициент масштабирования. Затем наращивать срез мозга в направлении Y , так что он достигнет уровня в нижней части окна Sub.
   4. Переименовать эти ломтики Brain_Slice_Big_ #.
   5. Проверьте Y Положение Oе оригинального Brain_Slice_ # щелкнув правой кнопкой мыши на части и выбора хода. Запишите положение Y для каждого из исходных Brain_Slice_ # ломтиков.
   6. Выполните вычисления: Brain_Slice_ # [Y позиция] - (Brain_Slice_Big_ # [Y размер] - Brain_Slice _ # [у размер])
   7. Выберите каждый из Brain_Slice_Big_ # индивидуально, щелкните правой кнопкой мыши и выберите шаг.
      1. Введите значение, рассчитанное из 10.2.6 в параметре перевода поле Y. Для параметров X и Z перевода, введите значения, расположенные в текущих полях параметров позиции. Выберите Absolute Translation. Нажмите на Перевести, и закройте окно.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Brain_Slice_Big_ # слайсы будут вычитаться вместе с мозгом и лезвиями, делая коробку.

11. Мартышка МРТ головного мозга Держатель для дополнительной проверки

1. Создание Cradle МРТ головного мозга
   1. Убедитесь , что верхняя поверхность CrAdle находится на той же высоте, что и Box_Cutout. Глубина и положение мозга в колыбели должна быть настроена так же, как это для резателя.
   2. Shift-выберите , чтобы выбрать Smoothed_Edited_Brain_Model и пеленок.
   3. Выберите логические операции. Выберите мозг, чтобы выделить его в красный цвет, а затем выберите Boolean вычитание. Затем примените расчеты. (Также выберите Brain_Slice_Big_ # ломтиков если это применимо.)
   4. Чтобы войти в режим восстановления, чтобы удалить любые острые моменты в люльке контура как это было сделано ранее для резателя. Выберите расширенный ремонт. Применить ремонт и удалить старую часть.
   5. Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы переименовать часть МРТ мозга пеленок. Выберите Экспорт, STL.
2. Печать люльку: Cura
   1. Импорт МРТ головного мозга в Cradle Курой и повернуть его так, чтобы плоская часть с вырезом мозга лицевой стороной вверх.
   2. Настройте параметры печати: разрешения слоя 0,1 мм, 100% плотности заполнения, плоту.
   3. Выберите путь для сохранения инструмента на SD-карте. (Время печати ~ 10 ч)
   4. Печать на Ultimaker 2, как описано в 8.3.
3. Получение высокого разрешения T2 * МРТ с использованием подставки
   1. Аккуратно сухой формалина с поверхности мозга с бумажным полотенцем.
   2. Поместите мозг в колыбели, как описано для резателя.
   3. Вставьте мозг и люльку в центрифужную пробирку 50 мл. Заполните его до краев с фторированной маслом.
   4. Слегка сожмите трубку, чтобы пузырьки воздуха бежать из мозга. Вставьте крышку вставить в врезке колпачка трубки предотвращает образование воздушных пузырей от формирования там. Закрепите крышку, и запечатать трубу с парафином.
   5. Поместите трубку в катушку, как это описано ранее. 3D T2 * параметры приведены в таблице 1.
   6. Открыть 18 анатомических 100 мкм Т2 * -weighted приобретения в Mipav и зарегистрировать на приобретение 10 ^тыс. регистрационные параметры такие же, как в 1.1.7. Среднее значение на основании зарегистрированных изображений: Utilities, изображения калькулятор-Bulk изображения, среднее.

Результаты

Технологический процесс этого метода приводится на рисунке 1. Как только мозг разрезается, визуальное сравнение между изображениями MR и фотографиями поверхностных поверхностей плит показывает хороший матч ориентации между несколькими плитами (рисунок 2). После того, как плиты погружают в парафин, они подразделяются на микротома и окрашивают. Более тщательное сравнение между высоким разрешением посмертных МРТ и окрашенных срезов гистологии демонстрирует точную и последовательную матч во всех структурах головного мозга мартышки (рисунок 3).

В этой животной модели МС, животные развиваются поражения белого вещества распространилась по всей коре головного белого вещества. Эти повреждения могут быть обнаружены неинвазивным путем проведения МРТ. Рисунок 4 демонстрирует способность этой методики, чтобы пролить свет на патологический субстрат результатов МРТ. Небольшие повреждения , обнаруженные на МРТ в естественных условиях можетотслеживаться на обоих посмертных МРТ и гистологии. Как показано на вставках, демиелинизация в очагах поражения является одним из основных компонентов, привело к изменению МР сигнала (гиперинтенсивности по сравнению с окружающей тканью). Гистологии и посмертных МРТ также может показать повреждения непринятых на в естественных условиях МРТ (рисунок 4).

Рисунок 1. Рабочий процесс для создания SLICER окно мартышка мозга. Мозг фиксировали формалином (А1) и Т2-взвешенных МРТ приобретается с изотропными вокселей 150 мкм на краю (A2). Изображения обрабатываются и порогами, чтобы создать бинарную маску (A3). Поверхность затем превращали в области программного обеспечения для 3D моделирования (A4). Логическое вычитание между шаблоном слайсера и модели мозга создает цифровую модель резателя мозга (B1). Ломтерезки коробка мозга печатается на 3D-принтере (В2). Мозг затем помещается твердо в поле слайсера длярежущая (В3). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Слева направо: В естественных условиях МРТ, посмертных МРТ и ткани сляба фотографию. Были созданы нарезка самолетов на основании патологоанатомического МРТ (Б) и визуально по сравнению с соответствующим в естественных условиях МРТ срез (A). Мозг был вырезан, и были найдены результирующие плиты, чтобы соответствовать (С). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Высокое разрешение посмертных МРТ и гистологияраздел соответствия. Слябы заключали в парафин, разрезали микротомом на секции 4 мкм, и окрашивали с быстрым синим и крезиловым фиолетовым (B). Срезы затем визуально сочетается с Т2 100 мкм * -weighted МРТ основаны на структурах мозга (А). Детали для приобретения этого изображения находятся в дополнительном разделе протокола и Таблица 1. Мозговые структуры: (1) красная стрелка = внутренняя капсула, синяя стрелка = передней спайки; (2) красная стрелка = скорлупа, синяя стрелка = оптический тракт; (3) красная стрелка = хвостатое, синяя стрелка = гиппокампе; (4) красная стрелка = мозолистое, синяя стрелка = водопровод мозга; (5) красная стрелка = уступает бугорок, синяя стрелка = пирамидальный тракт. Пунктирным прямоугольником в B1 указывает на срез, где, как во время резки мозга или парафин, ошибка вызвало небольшое вращение вокруг оси Y, что приводит к несоответствию передней спайки слева. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотраБольшая версия этой фигуры.

Рисунок 4. Отслеживание поражений от МРТ в естественных условиях в гистологии секции. В естественных условиях МРТ не показала никаких убедительных доказательств аномального сигнала гиперинтенсивности предложить повреждения в любом зрительном тракте (А1). Тем не менее, высокое разрешение посмертных МРТ показывает четкие гипер интенсивные линии в обоих зрительных трактов (А2). Быстрый синий / фиолетовый крезил пятно гистологии секции 4 мкм показывает , что гиперинтенсивных участки видны на экс естественных условиях МРТ являются демиелинизированные (A3). В коре головного белого вещества, в естественных условиях МРТ показывает тонкие гиперинтенсивности на двусторонней основе (В1, увеличенный на вставках). Районы гиперинтенсивных более очевидны на высоком разрешении посмертных МРТ (B2). LFB пятно гистологии секции 4 мкм показывает, что эти участки демиелинизированные (B3). После того, как по сравнению с базовым Iп естественных условиях МРТ и hemotoxylin-и-эозином пятно, правая сторона была определена как анатомическая аномалия, а не демиелинизированные поражения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительные файлы кода. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот файл. Brain_Slicer_Parts_Human.stl: Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот файл. Cap_Insert.stl: Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Протокол указано здесь дает точное сравнение между МРТ и гистологии секций. Протокол представлен в едином формате, который может быть применен к мозгу человека или мелких животных, таких, как мартышек или грызунов. Различия, характерные для больших (человека) и малые (нечеловеческий примат и грызунами) мозги подсвечиваются, а в сопроводительном видео и цифры, которые мы демонстрируем применение в мартышки. Несмотря на то, подход прост, метод требует много стадий, а также использование нескольких типов программного обеспечения. Кроме того, несколько вопросов, которые могут повлиять на точность этого метода важно упомянуть.

Качество изображения в естественных условиях МРТ является важным фактором. Чтобы свести к минимуму неравенство в разрешении изображения между МРТ и оцифрованных изображений гистологических, следует использовать наименьший возможный размер МРТ вокселей. Эта концепция также относится и к качеству изображения посмертном МРТ. В то время как увеличениевремя сбора в посмертных МРТ позволяет значительно более высокое разрешение изображения, препарат может ввести артефакты изображения, такие как узловые бросивших сигналов, связанных с воздушными пузырьками. Эти артефакты могут затенить участки ткани, а также влияет на его контур. Кроме того, размеры ткани на посмертных МРТ, вероятно, будут затронуты в процессе фиксации и длительности. В то время как в естественных условиях в естественных условиях экс матча МРТ может быть тесно сближены с использованием анатомических ориентиров в программе настройки геометрии среза во время приобретения, нелинейную регистрация будет по- прежнему необходимо достичь более высокой степени точности в соответствие эти два МРТ изображения.

Конструкция держателя мозга и ломтерезки также является важным шагом. При создании цифровой модели мозга, алгоритм сглаживания применяется, что слегка увеличивает модели относительно неподвижного мозга. Это позволяет легко вставлять мозга в держатель и ломтерезки и уменьшает острые углы держателя &# 39, S контур. Тем не менее, если модель является слишком большим (например, более чем на 5%), мозг может двигаться во время посмертных МРТ и / или секционирования. Другим важным моментом является то, чтобы адаптировать дизайн модели мозга так, что мозжечок правильно размещен внутри 3D печатного объекта. Это может быть особенно сложным, когда мозжечок был поврежден во время извлечения мозга при аутопсии.

При печати резателя мозга и держатель, тип 3D-принтер должен также быть тщательно подобраны. Некоторые мульти-струйных принтеров требуют последующей обработки с использованием печи для удаления материала подложки. В то время как эти принтеры могут производить объекты, которые являются водонепроницаемыми и относительно более прочным, чем для настольных слиты моделирования осаждения (FDM) принтеров, процесс нагрева, чтобы удалить опоры может слегка деформировать коробку, создавая пробелы лезвия, которые не являются строго перпендикулярно к контуру мозга.

Процесс мозга секционирования является еще одним важным шагом. Перед стрижкой тысе весь мозг в слябы, важно, чтобы убедиться, что мозг плотно сидит внутри резателя мозга: не должно быть никакого движения, когда небольшое давление наносят на мозг. Это сделает возможным для лезвий, чтобы прорваться через мозг в точном месте, установленном следователями. Непрерывный, сбалансированное давление должно применяться к обоим держателям лезвий при резке. В зависимости от остроты лезвий и жесткости ткани, небольшое поперечное движение резания может быть выгодным для поддержания плоских поверхностей реза.

Процесс парафино-вложение может также быть источником рассогласования между МРТ и гистологии. Если горбыль ткань не сидит прилегать к кассете во время процесса погружения, будет наклон между секущей плоскостью микротома и поверхностью вместо плиты. Это потребует резки непригодные секций, чтобы найти плоскую плоскость, в которой подвергается вся ткань. Один из способов коррекции наклонаэто путем изменения угла плоскости наблюдения на посмертных МРТ высокого разрешения изотропным. Тем не менее, это практически невозможно выполнить на естественных условиях МРТ в том, что обычно приобретается с разрешением анизотропного (обычно имеет толщину корональные слайсы).

И, наконец, ткань может испытывать некоторую деформацию в течение периода фиксации формалином и парафин (усадка), а также во время подготовки слайдов (складывающиеся, образование трещин, морщин). Некоторые из этих деформаций может быть исправлено путем помещения секции на водяной бане 4-5 мкм перед передачей на предметные стекла. Другие деформации могут быть частично решены путем выполнения деформируемый изображения Корегистрация из гистологических оцифрованных изображений посмертных МРТ изображений. Тем не менее, сводя к минимуму деформации с тщательной и квалифицированной практикой является наиболее эффективным подходом к соответствию объемов МРТ для гистологии секции.

В заключение отметим, что методология введена здесь позволяет инвestigators точно оценить основной патологии выводов МРТ. В более общем смысле, это является перспективным подходом для идентификации и / или проверки новых МРТ биомаркеров для научных исследований, нацеленных на конкретные патологические процессы, такие как воспаление или ремиелинизации.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI	Bruker Biospin
38 mm Bruker Biospin volume coil	Bruker Biospin
Fomblin	Solvay Solexis
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	21008-951
Fisherbrand Gauze Sponges	Fisher Scientrific	13-761-52
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film	Bemis
Leica RM2235 rotary microtome	Leica
Leica Disposable Blades, low profile (819)	Leica
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous	Electron Microscopy Sciences	26089-01
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol	Electron Microscopy Sciences	26056-15
ETOH
Ultimaker 2 Extended	Ultimaker
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA  Filament, 2.85 mm, Silver Metallic	Ultimaker
Axio Observer.Z1	Zeiss
Zen 2 (Blue Edition)	Zeiss
Netfabb Professional 5.0.1	Netfabb	http://www.netfabb.com/professional.php
Meshmixer 10.9.332	Autodesk	http://www.meshmixer.com/download.html
Mipav 7.2	NIH CIT	http://mipav.cit.nih.edu
Cura	Ultimaker	https://ultimaker.com/en/products/cura-software