JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для выявления и количественной оценки низкой обильные молекул в комплексные решения с помощью молекулярного импринтинга в сочетании с емкость биодатчик.

Аннотация

Способность обнаруживать и quantitate биомолекул в комплексные решения всегда была высоко востребованных в естественных наук; используется для обнаружения биомаркеров, загрязнений и других молекул интерес. Часто используемый метод для этой цели является энзим соединенный иммуноферментного анализа (ELISA), где часто одного антитела направлены на конкретных целевых молекулы, и второй обозначенное антитело используется для обнаружения основного антитела, позволяющие Абсолютная количественная оценка биомолекулы изучается. Однако использование антител, как признание элементов ограничивает надежность метода; равно как и необходимость использования помечены молекул. Чтобы преодолеть эти ограничения, были осуществлены молекулярного импринтинга, создание искусственных признание сайтов в дополнение к молекуле шаблон и файлы необходимость использования антител для первоначальной привязки. Кроме того для еще более высокой чувствительности, вторичные обозначенное антитело могут быть заменены биодатчики, полагаясь на емкости для количественного определения целевых молекулы. В этом протоколе мы опишем способ быстро и этикетка бесплатно обнаружить и quantitate низким обильные биомолекул (белков и вирусы) в сложных проб, с чувствительностью, что значительно лучше, чем широко используемых обнаружения системы, такие как ELISA. Это все при посредничестве молекулярного импринтинга в сочетании с емкость биодатчик.

Введение

Количественная оценка биомолекул используется во многих областях различных исследований в рамках науки, используя методы как радиоиммуноанализ (РИА) или ELISA1. Некоторые из этих методов требуют помечены реагент как радиоизотопные или фермента помечены антитела/antigen, что делает их трудоемким и длительным с сложные процедуры2. Кроме того надежность, избирательности и чувствительности этих методов не являются достаточными для всех анализов; в частности они не достаточно, когда attogram количества должны быть проанализированы, а пиктограмма количествах3. Для этой цели биосенсоры получили значительный интерес4,5, в частности в сочетании с молекулярного импринтинга для повышенной надежности.

Молекулярного импринтинга основывается на создании полостей, полимеризуя функциональных мономеров вокруг шаблона6, создавая искусственные признание сайты, которые прекрасно напоминать шаблон7. Этот метод был использован для ряда приложений, включая системы доставки наркотиков и аналитическое разделение, но и как biorecognition элементы в биодатчики8,9,10. Однако есть еще некоторые трудности в разработке молекулярно тисненой полимеров (MIPs) для высокомолекулярных шаблоны как белки и клетки11,12. Благодаря этому многие исследователи сосредоточили на импринтинга белка шаблон непосредственно на подложке, таким образом создавая поверхность, которая будет признана целевого белка12. Этот метод покрытия поверхности, используемых для найма признание полости для больших молекул и сборок, включая белки называется микроконтактной импринтинга13,14. Общая процедура метода зависит от полимеризации между двумя поверхностями - шаблон штампа и опора полимерная - на которых шаблон адсорбированные на одной поверхности15,16и принес в контакт с Мономер лечение поверхности. Таким образом на поддержку через УФ полимеризации формируется тонкой полимерной пленки. Наконец шаблон будет удален, оставив шаблон конкретных полостей на поверхности электрода, клеймения. Этот метод имеет некоторые преимущества, включая сокращение деятельности потери тисненой молекулы, а также как требующую очень небольшое количество молекул шаблон для импринтинг обрабатывать16,17. Таким образом эти экономически эффективных, стабильных, чувствительной и селективного поверхности могут создаваться на поверхности сенсора, таргетинга любой шаблон по выбору пользователя.

Биосенсор может использоваться для обнаружения одного белков и намного больше биомакромолекулах, включая вирусы. Конкретной группы вирусов, получить последние интерес является бактериофаг, который является вирус, который поражает бактерии. Быстрый и чувствительных обнаружения бактериофагов имеет важное значение во время биотехнологических и биофармацевтической процессов с целью определения инфекций бактериальной культуры с бактериофагов18. Наиболее часто используемые биологические assay для обнаружения бактериофага является двойной слой агар метод19, который является трудоемким и требует много времени. Для разработки новых диагностических инструментов для вирусов (включая бактериофагов) было предпринято несколько попыток атомно-силовой микроскопии (АСМ)20, интерферометрии21, электрохимии22и датчик системы23, 24. значительная работа была сосредоточена на биодатчики ввиду их преимущества, как легко работать, весьма чувствительны и способны реального времени измерения15,25. Определенный тип биосенсор на основе изменений в емкость. Эти емкостным биодатчики являются электрохимических датчиков, которые измеряют изменения в диэлектрических свойств, когда исследуемое вещество взаимодействует с элементом biorecognition на поверхности сенсора, вызывая снижение емкости2,4 . Емкостной биодатчики были использованы для обнаружения различных аналитов как антигенов, антител, белки и тяжелых металлов ионов6,26,27,28. Эти типы биосенсоров имеют много преимуществ как присущие быстротой, высокая чувствительность, простота, низкая стоимость, легко манипуляции и реальном времени измерения без маркировки29.

Метод, описанный здесь направлена на включение обнаружения и количественного определения низкого обильные биомолекул в весьма сложных образцах, без необходимости использования каких-либо маркировки. В частности метод наиболее полезен в диапазоне Атто пикограмм биомолекул, где другие коммерчески существующих инструментов не точно quantitate их цели.

протокол

1. модификация скользит крышка стекла (шаблон марок)

  1. Чтобы очистить скользит крышка стекла, погрузите их последовательно в 10 мл 1,0 М HCl, деионизированной воды, и 1,0 М NaOH, соответственно, для 10 минут в каждом шаге в ультразвуковой очистки при комнатной температуре.
    1. Сухие скользит крышка стекла с газом азота.
      Примечание: Скользит крышка сушатся испарением под струей газообразного азота.
  2. Погружайте очищенного и высушенного покрытия скользит в 10% (v/v), 10 мл раствора 3-амино пропил triethoxysilane (APTES) в этаноле за 1 ч до внедрения аминогруппами на поверхности стекла, при комнатной температуре.
    1. Промойте крышку скользит деионизированной водой.
    2. Сухие скользит крышка с газом азота.
  3. Погрузите APTES-модифицированные покрытия скользит в 5% (v/v), 10 мл раствора глютаральдегид в 10 мм фосфатного буфера (рН 7,4) за 2 ч для того чтобы активировать аминогруппами на поверхности, при комнатной температуре6,15.
    1. Промойте скользит крышка с 10 мм фосфатного буфера (рН 7,4), чтобы удалить избыток глютаральдегид от поверхности.
    2. Сухие скользит крышка с газом азота.
  4. Подготовка 1,0 мл раствора шаблон (белок/Бактериофаг) в 10 мм фосфатного буфера (рН 7,4) в концентрации 0,1 мг/мл.
    Примечание: Растворите 0,1 мг белка в 1,0 мл фосфатного буфера (10 мм, рН 7,4). При необходимости, спектрофотометр (280 Нм) могут быть использованы для определения концентрации белка.
    1. Падение 200 мкл этого шаблона решения на изменение скользит крышка и Инкубируйте на 4 ° C на ночь.
      Примечание: Решение избыток шаблон может использоваться для подготовки более шаблон марки 1-2 для использования в исследованиях, характеристика.
    2. Промойте скользит крышка с 10 мм фосфатного буфера (рН 7,4), чтобы удалить несвязанные шаблон с поверхности.
      Примечание: Для полоскания электродов, промойте их фосфатного буфера (10 мм, рН 7,4) для 30 s.
    3. Сухие скользит крышка с газом азота.
      Примечание: Скользит крышка должны храниться при температуре 4 ° C до тех пор, пока они используются в шаге полимеризации.

2. модификация емкостным Золотые электроды

  1. Очистить электроды, погружать электродов в небольшой стакан, последовательно, содержащий 5 мл этанола (70%), деионизированная вода, ацетон, деионизированной воды, кислой Пиранья решение (3:1, H2т4: H2O2, v/v) и деионизированной вода, соответственно, для 10 минут в каждом шаге, в ультразвуковой очистки при комнатной температуре.
    1. Сухие электродов с газом азота.
  2. Чтобы выполнить electropolymerization тирамин, подготовьте 8 мл 10 мм тирамин раствора в 10 мм фосфатного буфера (рН 7,4) содержащий этанола (2 мл)15.
    Примечание: Общий объем тирамин решения должны быть 8 мл в общей сложности, включая 2 мл этанола.
    1. Выполнять циклический вольтамперные сканирование (15 циклов) в этом решении, используя потенцио, охватывающей потенциальный диапазон 0 - 1,5 V (Ag/AgCl) и скорость сканирования 50 МВ/s30.
    2. Ополосните электроды деионизированной водой.
    3. Сухие электродов с газом азота.
  3. Погружать электрода в раствор, содержащий хлорид acryloyl 30 мм и 30 мм триметиламин в толуоле (Vвсего = 5 мл) при комнатной температуре на ночь6,15,30.
    1. Ополосните электроды деионизированной водой.
      Примечание: Для обеспечения лучшего удаления непрореагировавшего acryloyl хлорид и триметиламин остатков, это также можно мыть поверхности с NaOH после деионизированную воду.
    2. Сухие электродов с газом азота.

3. Подготовка шаблона запечатлел емкостным Золотые электроды

  1. Подготовка бактериофага запечатлел емкостным Золотые электроды
    1. До полимеризации Подготовьте мономера раствор, содержащий мономера (N-гидроксиметил акриламида) и крест-компоновщик (Полиэтиленгликоль-400-диметакрилата) в соотношении 1:5 (моль/моль) в 1 мл раствора фосфатного буфера 10 мм (рН 7,4).
      Примечание: Мономера раствор, содержащий мономера и крест-компоновщик может использоваться в различных соотношениях, или типы мономера и крест-компоновщик может быть изменена согласно шаблон для оптимизации конкретного взаимодействия.
    2. В этот раствор добавьте 1 мг фото-инициатора.
      Примечание: Если полимеризации проводится под УФ света, затем Фото инициатора должен использоваться для инициирования полимеризации. Если полимеризации производится методом радикальной полимеризации, необходимо изменить тип инициатора.
    3. Пипетка 1.5 мкл этого решения на золото поверхность модифицированных золото электрода.
      Примечание: Золотой поверхности электрода схематически показан на рисунке 1.
    4. Принесите отметку шаблон при контакте с мономера решение на верхней поверхности золота электрода.
    5. Инициировать УФ полимеризации (365 Нм, 400 Вт) и продолжаться в течение 15 мин31.
      Примечание: УФ полимеризации осуществляется внутри охлаждения кабинета, который установлен до-25 ° C до начала полимеризации. Затем свет УФ отверждения системы включена и полимеризация продолжается на 15 минут перед выключением свет УФ отверждения системы.
    6. Удалите отметку шаблон с поверхности с помощью щипцов.
      Примечание: При удалении шаблона штамп от поверхности, полимерные пленки на поверхности может быть поврежден. Таким образом отметку должны быть удалены с поверхности очень тщательно и медленно без применения силы.
    7. Промойте поверхность электрода деионизированной водой и высушить его с газом азота.
    8. Погружайте электродов в 1 мл 10 мм 1-dodecanethiol в этанол подготовлен для 20 минут для того чтобы покрыть отверстий на поверхности электрода.
    9. Ополосните электроды деионизированной водой и высушите электродов с газом азота.
  2. Подготовка белка запечатлел емкостным Золотые электроды
    1. До полимеризации, подготовить мономера раствор, содержащий мономеров (акриламид: 54 мг; N-hydroxymethylacrylamide: 140 мкл; N-isopropylacrylamide: 85.6 мг) и крест-компоновщик (methylenebisacrylamide: 9,5 мг) в 820 мкл ультра-чистой воды30,32.
    2. Подготовить 5% (v/v) N, N, N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) в ультра-чистой воде.
    3. 20 мкл раствора TEMED в раствор мономера и очистки азотом на 5 мин.
    4. Подготовка 10% (w/v) Аммония персульфат (APS) в ультра-чистой воде.
    5. Добавьте 20 мкл раствора APS в раствор мономера.
    6. Пипетка 1.5 мкл мономера раствора на поверхность модифицированных золото электрода.
    7. Принесите отметку шаблон контакт с поверхностью мономера лечение.
    8. Запустите полимеризации при комнатной температуре и продолжаться в течение 5 ч.
      Примечание: Для подготовки белка импринтированные золотых электродов, вместо УФ полимеризация, свободно радикальной полимеризации при комнатной температуре (25 ° C) выполняется с помощью APS и TEMED как инициатор катализатора.
    9. Осторожно снимите отметку шаблон с поверхности с помощью щипцов.
    10. Промойте электрод деионизированной водой и высушите с газом азота.
    11. Погружайте электродов в 1 мл 10 мм 1-dodecanethiol в этанол подготовлен для 20 минут для того чтобы покрыть отверстий на поверхности электрода.
    12. Ополосните электроды деионизированной водой и высушите электродов с газом азота.

4. Характеристика поверхности электрода с растровая электронная микроскопия (SEM)

  1. Установите образцы на алюминиевые держатели с ленты самоклеющиеся углерода.
  2. Герб электродов с 10 Нм Палладий/золото.
  3. Изучить электродов с SEM.

5. режиме реального времени емкостных измерений с помощью шаблона запечатлел емкостным Золотые электроды

  1. Вставьте тисненой емкостной Золотые электроды в ячейку электрохимических потока, интегрированной емкостной биодатчик.
  2. Подготовка 100 мл регенерации буфер (25 мм глицин HCl, pH 2.5, включая 50 мм Tween-20) и идущий буфер 1 Л (для бактериофага запечатлел системы: фосфата 10 мм, рН 7,4; для белка импринтированные системы: 50 мм трис-HCl, рН 7,4).
  3. Запустите анализ с впрыской регенерации буфера для восстановления системы и идущий буфер, чтобы заново сбалансировать системы для 25 мин.
  4. Подготовьте стандартный шаблон решения в диапазоне желаемой концентрации в управлении буфера.
    Примечание: Сначала Подготовьте запас шаблон решения путем растворения 0,1 мг белка, или примерно 108 pfu бактериофагов, в 1,0 мл фосфатного буфера (10 мм фосфат, рН 7,4). Затем подготовьте стандартные решения для калибровочной кривой, сделав десяти последовательных десятикратного разведениях от Стоковый раствор. Эти решения будут проанализированы с емкостным биосенсор на шаге 5.5. Концентрация белка может измеряться с помощью спектрофотометра (280 Нм). Для того чтобы измерить концентрацию бактериофага, может использоваться метод агар двойной слой, который описан в подробности раньше19.
  5. Придать 250 мкл этих стандартных решений последовательно к системе в оптимальных условиях (скорость потока: 100 мкл/мин, температура: 25 ° C).
    Примечание: В этом приложении, Стандартный белка решения были подготовлены в диапазоне концентрации 1,0 x 10-4 - 1,0 x 10-14, в то время как бактериофага концентрации были в диапазоне от 1,0 x 101 - 1,0 x 105 ОРП/мл. Решения были помещены в клапан впрыска и последовательно вводят в системе, инъекционных образцы в triplicates через единый шприцевый насос и многопортовых клапан. Уменьшение емкости после парентерального введения стандартных решений, вытекающих из привязки шаблона для клеймения полостей автоматически контролируется инструмент программного обеспечения.

Результаты

В соответствии с протоколом, согласно схеме на рис. 1, голые золото электрода будут отпечатаны с шаблон, представляющий структуру биомакромолекула. Этот электрод может применяться в емкостной биосенсора (рис. 2), позволяя стабильного применения шаблона на электрод и измерение изменений в емкости после привязки шаблона.

Схематическое представление емкостным биосенсор показан на рисунке 2. Centris насоса, который отвечает за непрерывной инъекции идущий буфер (10 мм фосфат, рН 7,4) и буфер регенерации (25 мм глицин HCl, pH 2.5) в ходе регенерации в ячейку потока, можно ясно увидеть на рисунке. В ячейку потока состоит из работы, ведения и Счетчик электродов. Клапан впрыска состоит из стандартных белка/бактериофага решений, которые проходят через дегазатор сначала и затем последовательно вводят в систему. Как только решения достичь рабочих электродом, вставить в ячейку потока, результат контролируется в режиме реального времени. Ёмкость ценности могут быть зарегистрированы, следуя sensorgrams на экране компьютера.

Рисунок 3 и 4 описывают различия между поверхностью голой и клеймения Золотые электроды. Этот шаг характеристика имеет важное значение для обеспечения полимерных штампов, рассматривается как шероховатости на поверхности электрода после импринтинга. Помимо SEM, существуют также другие методы характеристики AFM, контактный угол измерения, включая Эллипсометрия и т.д., который может использоваться для характеристики поверхности после импринтинга. Таким образом можно обеспечить, что процесс импринтинга является успешной и что шаблон полостей образуются на поверхности. В рамках этих полостей шаблон можно связать с высокой специфичности и сходства.

После парентерального введения стандартных растворов в емкостных систему, в среднем пять чтений вычисляется автоматически программное обеспечение, и калибровочные графики были получены путем построения изменения в емкость vs. концентрация исследуемое вещество. Уменьшение емкости зарегистрированных возникли из привязки шаблона. Больше молекул, которые связывают к электроду-золотой поверхности, тем выше сокращение общей емкости, согласно общему принципу емкостных измерений. Рисунок 5 и Рисунок 6 показывают, что с увеличением концентрации аналита, ΔC увеличивается, как ожидалось. Динамический диапазон (между которыми диапазон концентраций, где система будет полезна для обнаружения конкретной цели) и предел обнаружения (LOD) может оцениваться путем анализа этих графиков. Согласно рис. 6, емкостной биосенсор бактериофага типография может обнаружить бактериофагов в диапазон концентраций 101 - 105 ОРП/мл, с LOD значением 10 ОРП/мл в этом исследовании. Рисунок 5 и Рисунок 6 также подчеркнуть необходимость измерения калибровочной кривой в том же интервале необходимых для шаблона концентрация предполагается, поскольку линейность регрессии могут изменяться концентрации ( Рисунок 5), или имеют различные склонов (рис. 6). Следует также отметить, что из-за низких концентрациях используются, системы весьма чувствительны к колебаниям (помутнение в образец, проект воздуха и т.д.), и поэтому, рекомендуется выполнять по крайней мере triplicates уменьшить потенциал выбросов, включая . По той же причине стандартное отклонение может быть весьма существенным для сильно разбавленных образцов, как показано на рисунке 6.

figure-results-4031
Рисунок 1 . Схематическое представление микроконтактной импринтинга метод. (A) подготовка скользит крышка стекла (шаблон марок), (B) подготовка емкостным золотых электродов, (C) микроконтактной импринтинг шаблона на золото электрода поверхность через УФ полимеризации и (D) Удаление шаблона из поверхности электрода (воспроизводится от Эртюрк et al., биотехнологии доклады 2014 (3): 65-72 с разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4870
Рисунок 2. Схематическое представление емкостным биодатчик. Общая компоновка емкостным биосенсор, используемые в данном исследовании (воспроизводится от Эртюрк et al., биотехнологии доклады 2014 (3): 65-72 с разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5458
На рисунке 3. Сканирование электронной микроскопии белка запечатлел электродов. SEM изображения (A) голые золото электрода (шкалы бар = 20 мкм), и (B) белок запечатлел емкостным золото электрода (шкалы бар = 10 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6067
Рисунок 4. Сканирование электронной микроскопии бактериофага запечатлел электродов. SEM фото голой золото электрода (шкалы бар = 20 мкм) (A), и бактериофага запечатлел емкостным золото электрода в различных увеличениях (6600 x, шкалы бар = 10 мкм) (B) и 11, 500 X, шкалы бар = 5 мкм) (C); стрелки обозначают придерживался бактериофагов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6814
Рисунок 5. Влияние состава буфер для калибровки графов. Калибровка график, показывающий изменения в емкость vs. концентрацию белка в оптимальных условиях (работает буфер: 50 мм трис-HCl, рН 7,4; Регенерация буфера: 25 мм глицин HCl, pH 2.5, включая 50 мм Tween-20; Скорость потока: 100 мкл/мин, объем образца: 250 мкл; T: 25 ° C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-7503
Рисунок 6. Представитель Калибровочная кривая для больших биомакромолекулах. Калибровка график, который показывает изменение в емкость vs. бактериофага концентрация в оптимальных условиях (работает буфер: 10 мм фосфат, рН 7,4; Регенерация буфера: 25 мм глицин HCl, pH 2.5, включая 50 мм Tween-20; Скорость потока: 100 мкл/мин, объем образца: 250 мкл; T: 25 ° C) пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Когда этот метод осуществляется, есть некоторые важные шаги, которые должны рассматриваться при соблюдении Протокола. Одним важным шагом является очистки шаг с кислой Пиранья решения. Шаг 2.1 не должна быть более чем на 10 мин. Решение шаблона для шага 1.4 не должна превышать 0,1 мг/мл, так как эти значения были оптимизированы ранее. Циклических voltametric проверок не должна превышать 15 циклов для получения оптимальной толщины. Для шага 3.1.3 1,5 мкл значение оптимизированной. Это значение не должно быть выше для этого конкретного типа электрода. Если УФ-отверждения системы имеет мощность 400 Вт, полимеризации должны быть выполнены для максимум 10-15 мин. Как только APS (инициатор) добавляется в решение после TEMED, последующий шаг должны выполняться очень быстро, чтобы избежать немедленного полимеризации (шаг 3.2.5).

Одним из наиболее важных шагов является удаление шаблона штамп от поверхности после УФ полимеризации. Если этот шаг не выполняется должным образом, существует опасность того, что полимерные пленки на поверхности электрода может быть удален с печатью. Поэтому рекомендуется погружают электрод и отметку белка на вершине в растворе воды после полимеризации, а затем очень медленно и осторожно снять отметку поверхности (шаг 3.1.6).

На основе шаблона используется, изменения типа и соотношении мономеров используются (функциональных мономеров и крест-компоновщик) могут быть оценены с точки зрения создания более высокой чувствительности. Это должно быть определено эмпирически. Кроме того привязка сходство молекулы шаблон обычно включает в себя несколько различных взаимодействий одновременно. Таким образом это может привести к проблемам во время регенерации шаги. Если связанный шаблон не освобождается от поверхности должным образом, это может повлиять reusability электрода для дальнейшего анализа. Эти многоточечные сходство может также привести от привязки через слабые взаимодействия. В таких системах неспецифичный привязки может занять место, которое может отрицательно влиять избирательность системы16. Это типично и обще, ограничения метода.

Помимо этих конкретных ограничений есть много значительных преимуществ метода обсуждались над существующими методами. В то время как рис, ELISAs и флуориметрический измерения очень чувствительны, они требуют использование помеченных материала (шаблон или детектор), в то время как биодатчик является полностью лейбл бесплатно. Эти методы являются также более дорогим и трудоемким. Биосенсор подход позволяет для быстрого, параллельного синтеза MIPs в различных композиций на же время16. Поскольку для подготовки требуется только несколько микролитров раствора мономера, метод удобен при использовании дорогих или иным образом ограниченное мономеров. Кроме того, один MIP электродов может использоваться для примерно 80 анализы без значительного снижения производительности, которая значительно выше, чем другие существующие методы30. Существующие методы также страдают, в различной степени, низкой чувствительности и избирательности, а описан метод позволяет для выявления и количественной оценки молекул в диапазоне вечера с высокой селективности.

Из-за экономической эффективности, простота эксплуатации инструмента и реального времени обнаружения чувствительных в короткие сроки по сравнению с существующими методами, биосенсоры являются очень перспективными точки из систем обнаружения ухода в полевых условиях; например, для мониторинга окружающей среды и для применения в развивающихся странах. Во многих приложениях в диагностике заболеваний реального времени, чувствительных, селективный и быстрое обнаружение биомаркера в сложной смеси, такие как сыворотка является требуется15,25. Здесь биодатчики превосходят существующие методы, в частности, из-за их надежности и чувствительность. Специально для обнаружения инфекционных агентов бактериофагов недавно рассматриваются как альтернативные biorecognition элемент для биодатчики вследствие их принимающей бактерии специфичности33,34,35. Замена антител с бактериофагов является весьма перспективным для снижения стоимости и повышения стабильности еще36. Такая система также позволит для обнаружения и количественного определения конкретных бактериофагов в окружающей среде и из клинических образцов. Из-за распространенности бактериофагов и их способности передавать бактерии с генов антибиотикорезистентности37,38такой метод может быть ценным, изучение распространения устойчивых бактерий.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мария Баумгартен (IQ биотехнологии платформы, инфекции медицина, Лундский университет) признается за выполнение и обеспечение сканирования электронной микроскопии. Эта работа была поддержана грантов от шведского исследования Совета анкетах (2017-00100) в рамках Европейской третьего совместного программирования инициативы по вызову антимикробной сопротивления (JPIAMR) «Динамика передачи.» Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, интерпретация, письма, подготовка рукописи, решение представить, или решение опубликовать работу.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass Cover slipsThermoFisher102222protein stamp
HClSigma-AldrichH1758-500MLcleaning
NaOHSigma-Aldrich72068-100MLcleaning
Ultrasonic cleanerBranson UltrasonicBRANSONIC M1800- Ecleaning
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES)Sigma-AldrichA3648-100MLmodification
EtOHSigma-Aldrich1009836010rinsing/cleaning
glutaraldehydeSigma-AldrichG5882-100MLcross-linker
acetoneSigma-Aldrich34850-1L-Mcleaning
H2SO4Sigma-Aldrich339741-100MLpiranha solution
H2O2Sigma-AldrichH1009-500MLpiranha solution
tyramineSigma-AldrichT90344-5Gmodification
CompactStatIvium TechnologiesCompactStat.h: 30mA@10V/3MHzpotentiostat
Platinum Counter Electrode KitEquilabriumAFCTR5potentiostat
Reference ElectrodeEquilabriumRREF0021potentiostat
acryloyl chlorideEMD Millipore8.00826.0100modification
triethylamineEMD Millipore8.08352.0100modification
tolueneSigma-Aldrich244511-100MLmodification
N-hydroxymethyl acrylamideSigma-Aldrich245801-100Gfunctional monomer
poly ethylene glycol-400-dimethacrylateSigma-Aldrich409510-250MLcross-linker
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenoneSigma-Aldrich410896-50Gfunctional monomer
UV polymerizatorDymaxDymax 5000ECEUV-polymerization
forcepsSigma-AldrichZ168777-1EAconsumable
1-dodecanethiolSigma-Aldrich471364-100MLblocking agent
acrylamideSigma-AldrichA3553-100Gfunctional monomer
N-hydroxymethylacrylamideSigma-Aldrich245801-100Gfunctional monomer
N-isopropylacrylamideSigma-Aldrich415324-50Gfunctional monomer
methylenebisacrylamideSigma-Aldrich146072-500Gcross-linking monomer
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281-25MLcatalyst
ammonium persulphateSigma-AldrichA3678-25Ginitiator
Capacitive biosensorCapSenzeEquipment
GlycineMerck1042011000regeneration buffer
Tween-20Sigma-AldrichP9416-50MLregeneration buffer
Trizma baseSigma-Aldrich93352-1KGrunning buffer
Na2HPO4 • 2H2OCalbiochem567547-1KGrunning buffer
NaH2PO4 • 2H2OCalbiochem567549-1KGrunning buffer
DELPHI correlative light and electron microscopePhenom-Worldequipment
Capacitive gold electrodesCapSenze Biosystemsconsumables
2,2'-azobis(2-methypropionitrile)Sigma-Aldrich441090-25Gphoto-initiator
CapSenze Smart SoftwareCapSenze Biosystemssoftware program

Ссылки

  1. Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor. Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).
  2. Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive Biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
  3. Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. P., Huo, Q. Predicting detection limits of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and bioanalytical techniques in general. The Analyst. 139 (2), 439-445 (2014).
  4. Mattiasson, B., Teeparuksapun, K., Hedström, M. Immunochemical binding assays for detection and quantification of trace impurities in biotechnological production. Trends in Biotechnology. 28 (1), 20-27 (2010).
  5. Limbut, W., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Capacitive biosensor for detection of endotoxin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (2), 517-525 (2007).
  6. Ertürk, G., Berillo, D., Hedström, M., Mattiasson, B. Microcontact-BSA imprinted capacitive biosensor for real-time, sensitive and selective detection of BSA. Biotechnology Reports. 3, 65-72 (2014).
  7. Arshady, R., Mosbach, K. Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization. Macromolecular Chemistry and Physics. 182 (2), 687-692 (1981).
  8. Andersson, L. I. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field. Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications. 745 (1), 3-13 (2000).
  9. Li, X., Husson, S. M. Two-dimensional molecular imprinting approach to produce optical biosensor recognition elements. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (23), 9658-9663 (2006).
  10. Alexander, C., Davidson, L., Hayes, W. Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis. Tetrahedron. 59 (12), 2025-2057 (2003).
  11. Kryscio, D. R., Peppas, N. A. Surface imprinted thin polymer film systems with selective recognition for bovine serum albumin. Analytica Chimica Acta. 718, 109-115 (2012).
  12. Inerowicz, H. D., Howell, S., Regnier, F. E., Reifenberger, R. Multiprotein immunoassay arrays fabricated by microcontact printing. Langmuir. 18 (13), 5263-5268 (2002).
  13. Lin, H. Y., Hsu, C. Y., Thomas, J. L., Wang, S. E., Chen, H. C., Chou, T. C. The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin. Biosensors and Bioelectronics. 22 (4), 534-543 (2006).
  14. Liao, P. C., Tyan, Y. C., Wang, C. Y., Hsu, J. F., Chou, T. C., Lin, H. Y. Assessing the binding selectivity of molecularly imprinted polymer artificial antibodies by mass spectrometry-based profiling system. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 91 (2), 597-604 (2009).
  15. Ertürk, G., Hedström, M., Tümer, M. A., Denizli, A., Mattiasson, B. Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors. Analytica Chimica Acta. 891, 120-129 (2015).
  16. Ertürk, G., Mattiasson, B. From imprinting to microcontact imprinting-A new tool to increase selectivity in analytical devices. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1021, 30-44 (2016).
  17. Ertürk, G., Mattiasson, B. Molecular Imprinting: The Creation of Biorecognition Imprints on Biosensor Surfaces. Advanced Molecularly Imprinting Materials. , 523-560 (2017).
  18. Janczuk-Richter, M., et al. Long-period fiber grating sensor for detection of viruses. Sensors and Actuators B: Chemical. 250, 32-38 (2017).
  19. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology. 501, 69-76 (2009).
  20. Meillan, M., et al. Self-assembled monolayer for AFM measurements of Tobacco Mosaic Virus (TMV) at the atomic level. RSC Adv. 4 (23), 11927 (2014).
  21. Ymeti, A., et al. Fast, ultrasensitive virus detection using a Young interferometer sensor. Nano Letters. 7 (2), 394-397 (2007).
  22. Wei, Y., Wong, L. P., Toh, C. -. S. Fuel cell virus sensor using virus capture within antibody-coated nanochannels. Analytical Chemistry. 85 (3), 1350-1357 (2013).
  23. Guliy, O. I., et al. Immunodetection of bacteriophages by a piezoelectric resonator with lateral electric field. Applied biochemistry and microbiology. 52 (4), 457-463 (2016).
  24. Reta, N., Michelmore, A., Saint, C., Prieto-Simón, B., Voelcker, N. H. Porous silicon membrane-modified electrodes for label-free voltammetric detection of MS2 bacteriophage. Biosensors & Bioelectronics. 80, 47-53 (2016).
  25. Ertürk, G., Özen, H., Tümer, M. A., Mattiasson, B., Denizli, A. Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 224, 823-832 (2016).
  26. Lebogang, L., Mattiasson, B., Hedström, M. Capacitive sensing of microcystin variants of Microcystis aeruginosa using a gold immunoelectrode modified with antibodies, gold nanoparticles and polytyramine. Microchimica Acta. 181 (9-10), 1009-1017 (2014).
  27. Loyprasert, S., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor. Biosensors & Bioelectronics. 25 (8), 1977-1983 (2010).
  28. Teeparuksapun, K., Hedström, M., Wong, E. Y., Tang, S., Hewlett, I. K., Mattiasson, B. Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen using nanofunctionalized surfaces in a capacitive immunosensor. Analytical Chemistry. 82 (20), 8406-8411 (2010).
  29. Labib, M., Hedström, M., Amin, M., Mattiasson, B. A capacitive biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (5), 1539-1544 (2009).
  30. Ertürk, G., Hedström, M., Mattiasson, B. A sensitive and real-time assay of trypsin by using molecular imprinting-based capacitive biosensor. Biosensors & Bioelectronics. 86, 557-565 (2016).
  31. Ertürk, G., Uzun, L., Tümer, M. A., Say, R., Denizli, A. Fab fragments imprinted SPR biosensor for real-time human immunoglobulin G detection. Biosensors & Bioelectronics. 28 (1), 97-104 (2011).
  32. El-Sharif, H. F., Phan, Q. T., Reddy, S. M. Enhanced selectivity of hydrogel-based molecularly imprinted polymers (HydroMIPs) following buffer conditioning. Analytica Chimica Acta. 809, 155-161 (2014).
  33. Wang, F., et al. Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors. Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).
  34. Chin, B. A., et al. Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors. 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).
  35. Park, M. -. K., Chin, B. A. Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil. Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).
  36. Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -. K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce. Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).
  37. Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples. Plos One. 6 (3), 17549 (2011).
  38. Lood, R., Ertürk, G., Mattiasson, B. Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle. Frontiers in microbiology. 8, (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

132

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены