JoVE Logo
저자
연락처

로그인

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

여기, 선물이 커패시턴스 바이오 센서와 함께에서 각 인 분자를 사용 하 여 복잡 한 솔루션에서 검색 및 낮은 풍부한 분자의 정량화에 대 한 프로토콜.

초록

감지 하 여 복잡 한 솔루션에 쓰이므로 quantitate 능력 항상 자연 과학; 내에서 매우 인기 있다 생체, 오염 물질, 그리고 관심의 다른 분자의 탐지를 위해 사용 되 고. 이 목적을 위해 일반적으로 사용 되는 기술 되는 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 어디 자주 한 항 체는 특정 대상 분자 향해 이동 하 고 기본 항 체의 검출에 사용 되는 두 번째 레이블이 항 체, 수은 연구 biomolecule의 절대 정량화입니다. 그러나, 인식 요소 항 체의 사용 제한 방법;의 견고성 사용 하 여 필요 마찬가지로 분자 분류. 이러한 한계를 극복 하기 위해 분자 각 인 구현 되었습니다, 인공 인식 사이트 템플릿 분자를 보완 만들고 obsoleting 초기 바인딩에 대 한 항 체를 사용 하 여의 필요성. 또한, 더 높은 감도 위한 보조 분류 항 체 바이오 센서는 대상 분자의 정량화에 대 한 커패시턴스에 의존 하 여 교체할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리 감지 하 여 신속 하 고 레이블 없는 감도 크게는 ELISA 등 일반적으로 사용된 탐지 시스템 보다 더 복잡 한 샘플에 낮은 풍부한 생체 (단백질과 바이러스)을 quantitate 메서드를 설명 합니다. 이 모든 커패시턴스 바이오 센서와 함께에서 분자 각 인에 의해 중재 됩니다.

서문

생체의 정량화는 과학, 방사 면역 검정 법 (RIA) 또는 ELISA1같은 방법을 채용 시간 많은 다른 연구 분야에 사용 됩니다. 이러한 방법 중 일부는 레이블이 필요 방사성 또는 효소 시 약 분류 항 체/항 원, 노동 집약 및 복잡 한 절차2시간이 걸리는 게. 또한, 이러한 방법의 감도, 선택도, 견고성 충분 하지 않습니다 모든 분석; 특히 그들은 충분 하지 않습니다 attogram 수량 그림 수량3보다 분석할 필요가 있을 때. 이 위해 바이오 센서 얻고 있다 상당한 관심4,5, 특히 증가 된 견고성에 대 한 분자 각 인와 함께.

분자 각 인 polymerizing 템플릿6, 인공 인식 있는 사이트를 만드는 템플릿을7을 완벽 하 게 닮은 주위 기능 단위체에 의해 구멍을 만드는 방법에 의존 합니다. 이 기술은 바이오 센서8,,910biorecognition 요소 뿐만 아니라 여러 응용 프로그램, 약물 전달 시스템 등 분석 분리 사용 되었습니다. 그러나, 여전히 분자로 각 인된 고분자 (MIPs) 단백질 및 세포11,12같은 고분자 서식 파일의 디자인에 몇 가지 문제가 있습니다. 이 때문에, 많은 연구 자들은 따라서 대상 단백질12에 의해 인식 될 것 이다 표면 만드는 템플릿 단백질을 기판에 직접 각 인에 집중 했다. 큰 분자와 단백질을 포함 하는 어셈블리에 대 한 인식의 구멍을 고용에 대 한 사용이 표면 코팅 기술 microcontact13,14각 인 이라고 합니다. 두 표면 사이-서식 파일 스탬프와 고분자 지원-는 템플릿이 한 표면15,16, 흡착 및 접촉으로 가져 중 합에 따라 방법의 일반적인 절차는 단량체 처리 표면입니다. 이 방법으로 얇은 폴리머 필름 UV 중 합을 통해 지원에 형성 된다. 마지막으로, 서식 파일 제거 됩니다, 템플릿 찍힌된 전극의 표면에 특정 구멍 뒤에 남겨두고. 이 메서드는 일부 장점 찍힌된 분자의 감소 활동의 손실을 포함 한, 뿐만 아니라 필요한 매우 작은 양의 템플릿 분자는 각 인에 대 한 처리16,17. 따라서, 사용자의 선택의 어떤 템플릿을 대상으로 하는 센서 표면에 이러한 비용, 안정, 민감한, 그리고 선택적 서피스를 만들 수 있습니다.

바이오 센서는 단일 단백질 및 훨씬 더 큰 biomacromolecules, 바이러스 등의 검출에 대 한 사용할 수 있습니다. 최근 관심을 얻고 바이러스의 특정 그룹은 살 균 소는 박테리아를 감염 시키는 바이러스 이다. 살 균 소의 신속 하 고 중요 한 발견은 바이오 동안 중요 한 세균성 문화 살 균 소18의 감염을 결정 하기 위하여 의약품 프로세스. 살 균 소 검출에 대 한 가장 일반적으로 사용 되 생물 학적 분석 결과 더블 레이어 agar 방법19, 힘들고 시간이 소요. 원자 힘 현미경 (AFM)20, 간섭계21,22, 전기 화학 센서 시스템23, 등 여러 시도 바이러스 (살 균 소 포함)에 대 한 새로운 진단 도구 개발 되었습니다. 24. 일을 많이 하 고 운영 하 게 쉬운, 매우 민감한 실시간 측정15,25의 능력으로 그들의 이점 때문에 바이오 센서에 집중 되었습니다. 특정 유형의 바이오 센서 커패시턴스에서 변화를 기반으로 합니다. 이러한 용량 성 바이오 센서는 변화를 측정 하는 전기 화학 센서 유 전체 속성에는 분석 센서 표면에 biorecognition 요소와 상호 작용 하 때 일으키는 커패시턴스2,4 감소 . 용량 성 바이오 센서는 항 원, 항 체, 단백질, 및 중 금속 이온6,26,,2728같은 다양 한 analytes의 탐지를 위해 이용 되었다. 이러한 종류의 바이오 센서는29라벨 없이 고유의 속도, 높은 감도, 단순, 저렴 한 비용, 쉬운 조작, 그리고 실시간 측정 같은 많은 이점이 있다.

여기에 설명 된 방법은 탐지 및 정량화 어떤 라벨을 사용 하 여 필요 없이 매우 복잡 한 샘플에 낮은 풍부한 생체의 목적 이다. 특히, 기술은 다른 상업적으로 기존 악기를 정확 하 게 그들의 목표를 quantitate 실패 쓰이므로, atto picogram 범위의 가장 유용 하다.

프로토콜

1. 수정 유리 커버의 전표 (템플릿 우표)

  1. 유리 커버 전표를 청소 하려면 젖어 그들 순차적으로 1.0 M HCl, 이온된 수, NaOH의 1.0 M의 10 mL에 각각, 상 온에서 초음파 세탁 기술자의 각 단계에서 10 분.
    1. 건조 질소 가스로 유리 커버 전표.
      참고: 표지 전표 기체 질소의 흐름에서 증발에 의해 건조 됩니다.
  2. 10% (v/v), 3-아미노-틸-triethoxysilane (항) 1 시간 실 온에서 커버 유리 표면에 아미노 그룹을 소개 하는 것에 대 한 에탄올에서의 10 mL 해결책에서에서 청소 하 고 건조 커버 슬립을 담가.
    1. 이온을 제거 된 물으로 커버 전표 린스.
    2. 건조 질소 가스로 커버 전표.
  3. 5% (v/v), 상 온6,15에서 표면에 아미노 그룹을 활성화 하려면 2 h의 10 m m 인산 버퍼 (pH 7.4)에 10 mL 해결책에서에서 항 수정 커버 슬립을 담가.
    1. 10 m m 인산 버퍼 (pH 7.4)와 커버 슬립 표면에서 과잉도 제거 하기 위해 린스.
    2. 건조 질소 가스로 커버 전표.
  4. 1.0 mL 0.1 mg/mL 농도에서 10 m m 인산 버퍼 (pH 7.4)에 템플릿 (단백질/살 균 소) 솔루션의 준비.
    참고: 0.1 mg 1.0 mL의 인산 염 버퍼 (10 m m, pH 7.4)에 단백질의 분해. 필요한 경우, 한 분 광 광도 계 (280 nm) 단백질 농도 결정 하는 데 사용할 수 있습니다.
    1. 수정 된 커버 슬립에이 서식 파일 솔루션의 200 µ L를 삭제 하 고 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
      참고: 1-2 더 많은 템플릿 우표 특성 연구에 사용할 수를 준비 하는 초과 템플릿 솔루션을 사용할 수 있습니다.
    2. 표면에서 언바운드 템플릿을 제거 하려면 10 m m 인산 버퍼 (pH 7.4)와 커버 슬립을 씻어.
      참고: 전극, 린스에 그들을 씻어 30 인산 버퍼 (10 m m, pH 7.4) s.
    3. 건조 질소 가스로 커버 전표.
      참고: 표지 전표 중 합 단계에서 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 되어야 한다.

2입니다. 용량 성 금 전극의 수정

  1. 전극을 청소, 순차적으로, 작은 비 커에 전극을 담가 (70%), 에탄올 5 mL를 포함 하 이온 물, 아세톤, 이온된 수, 산 성 피 솔루션 (3:1, H2이렇게4: H2O2, v/v), 그리고 이온 물, 상 온에서 초음파 세탁 기술자의 각 단계에서 10 분 동안 각각.
    1. 건조 질소 가스와 전극.
  2. Tyramine의 electropolymerization를 수행 하기 위해 8 mL 10 m m 인산 버퍼 (pH 7.4) 포함 에탄올 (2 mL)15에서 10 mM tyramine 솔루션의 준비.
    참고: tyramine 솔루션의 전체 볼륨 2 mL의 에탄올을 포함 하 여 총에서 8 mL 이어야 합니다.
    1. 검사 순환 voltammetric (15 주기)는 잠재력을 다루는 potentiostat를 사용 하 여이 솔루션에서 범위 0-1.5 V (Ag/AgCl) 및 스캔 속도 50 mV/s30의.
    2. 전극 이온된 물으로 린스.
    3. 건조 질소 가스와 전극.
  3. 30 mM acryloyl 염화 및 톨루엔에 30mm trimethylamine 포함 하는 솔루션에 전극을 담가 (V총 5 mL =) 실 온에서 하룻밤6,,1530.
    1. 전극 이온된 물으로 린스.
      참고: 염화 그리고 trimethylamine 잔류물 unreacted acryloyl의 더 나은 제거를 보장 하기 위해, 그것 또한 수는 이온된 수 후 NaOH와 표면 세척.
    2. 건조 질소 가스와 전극.

3. 준비 서식 파일의 각 용량 성 금 전극

  1. 살 균 소의 준비 표기 용량 성 금 전극
    1. 이전에 중 합, 단위체 (N hydroxymethyl 아크릴 아 미드)와 10 m m 인산 버퍼 (pH 7.4)의 1 mL에 1:5 (mol/mol)의 비율로 cross-linker (폴 리 에틸렌 글리콜-400-dimethacrylate)를 포함 하는 단위체 솔루션을 준비 합니다.
      참고: 포함 하는 단위체와 cross-linker 단위체 솔루션에서에서 사용할 수, 다른 비율 또는 단위체와 cross-linker 유형의 특정 상호 작용의 최적화에 대 한 서식 파일에 따라 변경 될 수 있습니다.
    2. 사진-개시자의 1mg이이 솔루션에 추가 합니다.
      참고: 경우는 합 UV 빛에서 수행, 다음 사진 초기자 사용 해야는 중 합을 시작 하. 자유 래 디 칼 중 합은 중 합 수행 하는 경우 초기자의 유형에 변경 되어야 합니다.
    3. 수정된 금 전극의 표면에 금이 솔루션의 1.5 µ L 플라스틱
      참고: 전극의 금 표면은 개요로 그림 1에 표시 됩니다.
    4. 골드 전극 표면 위에 모노 머 솔루션 문의 서식 파일 스탬프를가지고.
    5. UV 중 합 개시 (365 nm, 400 W) 15 분31계속.
      참고: UV 중 합은 중 합을 시작 하기 전에-25 ° C로 설정 되어 있는 냉각 캐비닛 내부 수행 됩니다. 그리고, 자외선 경화 시스템 켜져는 합 자외선 경화 시스템을 끄기 전에 15 분 동안 계속 된다.
    6. 집게를 사용 하 여 표면에서 서식 파일 스탬프를 제거 합니다.
      참고: 표면에서 서식 파일 스탬프를 제거 하는 동안 표면에 고분자 필름 손상 될 수 있습니다. 따라서, 스탬프 제거 되어야 합니다 표면에서 매우 신중 하 고 천천히 힘을 사용 하지 않고.
    7. 전극 표면 이온된 물으로 린스 하 고 질소 가스로 건조.
    8. 10 m m 1-dodecanethiol 전극 표면에 핀 홀을 커버 하기 위해 20 분에 대 한 에탄올에 준비의 1 mL에 전극을 담가.
    9. 전극 이온된 물으로 헹 구 고 건조 한 질소 가스와 전극.
  2. 단백질의 준비 표기 용량 성 금 전극
    1. 중 합, 사전 준비 포함 하는 단위체 단위체 솔루션 (아크릴: 54 밀리 그램; N-hydroxymethylacrylamide: 140 µ L; N-isopropylacrylamide: 85.6 mg)와 cross-linker (methylenebisacrylamide: 9.5 mg) 울트라 순수 물30,32의 820 µ L에서.
    2. 준비 5% (v/v) N, N, N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) 울트라 순수 물에서.
    3. 단위체 솔루션으로 TEMED 솔루션의 20 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 질소 가스 제거.
    4. 매우 순수한 물에 10% (w/v) 암모늄 persulphate (AP)를 준비 합니다.
    5. 20 µ L APS 솔루션의 단위체 솔루션에 추가 합니다.
    6. 수정된 금 전극 표면에 단위체 솔루션의 1.5 µ L 플라스틱
    7. 서식 파일 스탬프 단위체 처리 표면 접촉을 가져.
    8. 실 온에서 중 합을 시작 하 고 5 h 동안 계속.
      참고: 단백질 각 인 금 전극, UV 중 합, 대신의 준비에 대 한 실 온 (25 ° C)에서 무료로 급진적인 합 APS TEMED 시작자 촉매로 사용 하 여 수행 됩니다.
    9. 표면에서 서식 파일 스탬프 제거 신중 하 게 집게를 사용 하 여.
    10. 전극 이온된 물으로 헹 구 고 건조 한 질소 가스.
    11. 10 m m 1-dodecanethiol 전극 표면에 핀 홀을 커버 하기 위해 20 분에 대 한 에탄올에 준비의 1 mL에 전극을 담가.
    12. 전극 이온된 물으로 헹 구 고 건조 한 질소 가스와 전극.

4. 전극 표면 스캐닝 전자 현미경 (SEM)의 특성

  1. 표본 탄소 접착 테이프를 가진 알루미늄 홀더에 탑재 합니다.
  2. 10 nm 팔라듐/골드 전극 코트.
  3. SEM.와 전극 검사

5. 실시간 용량 측정 서식 파일을 각 용량 성 금 전극

  1. 용량 성 바이오 센서를 통합 하는 전기 흐름 셀으로 찍힌된 용량 성 금 전극을 삽입 합니다.
  2. 재생 버퍼 (25 m m 글리신-HCl, pH 2.5, 50 m m 트윈-20를 포함 하 여)와 1 L 실행 버퍼의 100 mL를 준비 (살 균 소에 대 한 각 인 시스템: 10 m m 인산 염, pH 7.4; 단백질을 각 시스템에 대 한: 50 mM Tris HCl, pH 7.4).
  3. 시스템 및 실행 중인 버퍼 다시 25 분을 위한 시스템을 equilibrate를 다시 생성 하려면 재생 버퍼의 주입으로 분석을 시작 합니다.
  4. 버퍼를 실행에 원하는 농도 범위에서 표준 서식 파일 솔루션을 준비 합니다.
    참고: 먼저 0.1 mg 단백질, 또는 약 108 pfu 살 균 소, 1.0 mL 인산 버퍼 (10 m m 인산 염, pH 7.4)에 용 해 하 여 서식 파일 솔루션의 재고를 준비 합니다. 다음, 재고 솔루션에서 10 연속 10 희석 하 여 보정 곡선에 대 한 표준 솔루션을 준비 합니다. 이러한 솔루션 단계 5.5에서에서 용량 성 바이오 센서와 분석 될 것 이다. 단백질 농도 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 될 수 있다 (280 nm). 살 균 소 농도 측정 하기 위하여는 더블 레이어 agar 방법은 사용할 수 있습니다,이 설명에 내용을 이전19.
  5. 최적의 조건에서 시스템을 순차적으로 이러한 표준 솔루션의 250 µ L를 주사 (유량: 100 µ L/min, 온도: 25 ° C).
    참고:이 응용 프로그램에 표준 단백질 솔루션 준비 되었다 10-4 -10-14, x 1.0 x 1.0의 농도 범위에서 살 균 소 농도 범위 1.0 x 101 -105 pfu/mL x 1.0에에서 동안. 솔루션 주입 밸브에 배치 하 고 순차적으로 단일 주사기 펌프 및 멀티 포트 밸브를 통해 triplicates에서 샘플을 주입 시스템에 주입 했다. 각 인된 충 치에 서식 파일의 바인딩에서 발생 하는 표준 솔루션을 주입 후 커패시턴스에서 감소는 악기의 소프트웨어에 의해 자동으로 모니터링 됩니다.

결과

그림 1, 회로도 따라 프로토콜에 따라 맨 골드 전극은 biomacromolecule의 구조를 나타내는 서식 파일 각 인 것 이다. 이 전극은 용량 성 바이오 센서 (그림 2) 커패시턴스는 서식 파일의 바인딩 시에 전극에 서식 파일의 안정적인 응용 프로그램 및 변화의 측정을 허용에 적용할 수 있습니다.

용량 성 바이오 센서의 도식 대표는 그림 2에 표시 됩니다. 흐름 세포로 재생 하는 동안 실행 중인 버퍼 (10 m m 인산 염, pH 7.4), 그리고 재생 버퍼 (25 m m 글리신-HCl, pH 2.5)의 연속 주입에 대 한 책임 centris 펌프는 그림에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 작업, 기준, 및 카운터 전극 흐름 셀에 의하여 이루어져 있다. 분사 밸브는 degasser 먼저 통과 표준 단백질/살 균 소 솔루션의 구성 후 시스템에 순차적으로 주입 하는 고. 최대한 빨리 솔루션 흐름 셀에 삽입 된 작업 전극에 도달, 결과 실시간으로 모니터링 됩니다. 커패시턴스 값은 컴퓨터 화면에는 sensorgrams에 따라 등록할 수 있습니다.

그림 3 및 그림 4 베어와 찍힌 골드 전극의 표면 사이의 차이 묘사. 이 특성화 단계는 각 인 후에 전극의 표면 거칠기로 본 고분자 충 치 확인 해야 합니다. 떨어져 SEM, AFM, 접촉 각 측정를 포함 하 여 다른 특성화 방법 있다 ellipsometry 등, 각 인 후 표면 특성을 사용할 수 있습니다. 이 방법으로 그것 수 지켜질 각 인 과정은 성공 하 고 템플릿 구멍 표면에 형성 된다. 이러한 충 치 내에서 서식 파일은 높은 특이성 및 선호도 바인딩할 수 있습니다.

지난 5 읽기의 평균 소프트웨어에 의해 자동으로 계산 된 용량 성 시스템에 표준 솔루션을 주입 후 고 캘리브레이션 그래프의 농도 대 용량 변화를 그려서 가져온는 분석입니다. 등록 된 커패시턴스에서 감소는 서식 파일의 바인딩에서 일어났다. 골드 전극에 바인딩되는 더 분자 표면, 높은 총 커패시턴스에서 감소 용량 측정의 일반적인 원칙에 따라. 그림 5 와 그림 6 그는 분석의 농도 증가 ΔC 증가 예상 대로 표시. (는 시스템은 특정 대상의 검출에 대 한 유용한 농도 범위는) 동적 범위와 감지 (LOD)의 한계는 이러한 그래프를 분석 하 여 평가할 수 있습니다. 그림 6에 따라 살 균 소 각 용량 성 바이오 센서 10의 농도 범위에서 살 균 소 감지할 수1 -105 pfu/mL,이 연구에서 10 pfu/mL의 LOD 값. 그림 5 와 그림 6 도 같은 간격에 보정 곡선을 측정의 필요성 강조 서식 파일 농도에 필요한 가정, 선형 회귀의 농도 ( 에 다를 수 있습니다 이후 그림 5), 또는 다른 슬로프 (그림 6). 또한 주목 해야 한다는 낮은 농도 사용, 시스템 변동 (샘플, 공기 초안, 등탁도), 매우 민감한 이며 따라서, 적어도 실행 되도록 것이 좋습니다 포함 outliers의 가능성을 줄이기 위해 triplicates . 그림 6에서 보듯이 같은 이유로 표준 편차는 매우 희석된 샘플에 대 한 매우 중요 한 수 있습니다.

figure-results-2228
그림 1 . Microcontact 메서드를 각 인 도식 표현. 유리 커버 전표 (템플릿 우표)의 (A) 준비 (B) 준비 용량 성 금 전극의 UV 중 합, 및 (D)를 통해 금 전극 표면에 서식 파일의 (C) microcontact 각 인 전극 표면에서 서식 파일의 제거 (Ertürk 외., 생명 공학 보고서 2014 (3)에서 재현: 허가 65-72). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2823
그림 2. 용량 성 바이오 센서의 도식 대표. 이 연구에 사용 된 용량 성 바이오 센서의 일반적인 레이아웃 (Ertürk 외., 생명 공학 보고서 2014 (3)에서 재현: 허가 65-72). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-3257
그림 3. 단백질의 전자 현미경 스캐닝 각 전극 인. (A) 맨 골드 전극의 SEM 이미지 (눈금 막대 = 20 µ m), 그리고 (B)는 단백질 각 용량 성 금 전극 (눈금 막대 = 10 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-3720
그림 4. 살 균 소의 전자 현미경 스캐닝 각 전극 인. 맨 골드 전극의 SEM 이미지 (눈금 막대 = 20 µ m) (A), 그리고는 살 균 소 각 용량 성 금 전극 다른 배율 (x, 눈금 막대 6600 = 10 µ m) (B), 11, 500 X, 규모 및 바 = 5 µ m) (C); 화살표 표시 준수 살 균 소). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-4268
그림 5. 교정 그래프에 대 한 버퍼 구성의 효과. 최적의 조건에서 단백질 농도 대 커패시턴스에서 변화를 보여주는 캘리브레이션 그래프 (실행 버퍼: 50 mM Tris HCl, pH 7.4; 재생 버퍼: 25mm 글리신-HCl, pH 2.5 포함 50 m m 트윈-20; 유량: 100 µ L/min, 샘플 볼륨: 250 µ L; T: 25 ° C)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-4785
그림 6. 큰 biomacromolecules에 대 한 대표적인 보정 곡선. 최적의 조건에서 살 균 소 농도 대 커패시턴스에서 변화를 보여 주는 교정 그래프 (실행 버퍼: 10 m m 인산 염, pH 7.4; 재생 버퍼: 25mm 글리신-HCl, pH 2.5 포함 50 m m 트윈-20; 유량: 100 µ L/min, 샘플 볼륨: 250 µ L; T: 25 ° C) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 방법을 실시 하는 경우 프로토콜을 수행 하는 동안 고려 되어야 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 하나의 중요 한 단계는 산 성 피 솔루션 청소 단계가 이다. 2.1 단계는 10 분 이상 되지 않아야 합니다. 이러한 값 이전 최적화 되어 이후 단계 1.4 서식 파일 솔루션 0.1 mg/mL을 초과 해서는 안. 최적의 두께 얻기 위해 순환 voltametric 검사 15 사이클을 초과 해서는 안. 3.1.3 단계 1.5 µ L 최적화 된 값입니다. 이 값이 특정 유형의 전극에 대 한 높은 되지 않아야 합니다. UV 경화 시스템 400 W의 파워를 가지는 중 합 10 ~ 15 분의 최대 수행 합니다. APS (초기자) TEMED 후 솔루션에 추가 되 자 마자 다음 단계 즉각적인 중 합 (3.2.5 단계)를 피하기 위해 매우 신속 하 게 수행 되어야 합니다.

가장 중요 한 단계 중 하나는 자외선 중 합 후 템플릿 스탬프 표면에서의 제거 이다. 전극의 표면에 고분자 필름 수 있는 위험이 있다이 단계를 제대로 수행 되지 않습니다 경우 스탬프와 제거. 따라서, 중 합, 후 전극 및 물 해결책에서 위에 단백질 스탬프를 담가 다음 (단계 3.1.6) 표면에서 아주 천천히 그리고 신중 하 게 스탬프를 제거 하는 것이 좋습니다.

사용 하는 서식 파일을 기반으로, 수정 유형 및 단위체 사용 (기능 단위체와 cross-linker)의 비율에 생성 하는 높은 감도 점에서 평가 될 수 있습니다. 이 실험적으로 결정 되어야 합니다. 또한, 일반적으로 서식 파일 분자에의 선호도 바인딩을 포함 동시에 여러 다른 상호 작용을 한다. 따라서,이 문제 재생 단계 동안 발생할 수 있습니다. 바인딩된 서식 파일 표면에서 제대로 해제 되지 않습니다, 경우 추가 분석을 위해 전극의 재사용 영향을 미칠 수 있습니다이. 이러한 멀티 선호도 또한 약한 상호 작용을 통해 바인딩에서 발생할 수 있습니다. 이러한 시스템에서 일반적인 바인딩 시스템16의 선택도 부정적인 영향을 미칠 수 있는 장소를 걸릴 수 있습니다. 이러한 방법의 일반적인, 그리고 일반, 제한이 있습니다.

이러한 특정 제한 외에도 기존 방법에 비해 논의 방법의 많은 중요 한 이점이 있다. 리아스식, ELISAs, 및 fluorometric 측정은 매우 민감합니다, 그들은 레이블된 자료 (서식 파일 또는 검출기)의 사용은 바이오 센서는 완전히 레이블 없는 필요 합니다. 이 메서드는 또한 더 비싼 및 시간이 걸리는. 바이오 센서 접근 동일한 시간16에 다른 작곡에 MIPs의 급속 하 고, 병렬 합성 수 있습니다. 단지 약간 microliters 단위체 솔루션의 준비를 위한 필요 때문에, 비싼 또는 기타 제한 된 단위체를 사용 하는 경우 메서드를 사용 하면 편리 하다. 또한, 단일 성능 측정 전극30다른 기존의 방법 보다 훨씬 높은 성능에 큰 감소 없이 약 80 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 기존의 방법 또한 고통, 낮은 감도 선택도의 다양 한 각도에서 설명한 메서드를 사용 하면 검출 및 정량화 오후 범위에 분자의 높은 선택도를.

비용 효율성, 악기, 그리고 기존의 방법에 비해 짧은 시간에 민감한 실시간 감지 작동의 용이성 때문에 바이오 센서는 매우 유망한 포인트의 케어 탐지 시스템 필드 조건; 예를 들어, 환경 모니터링 및 응용 프로그램 개발 도상국. 질병의 진단에서 많은 응용 프로그램에서의 혈 청 등 복잡 한 혼합물에서 바이오 마커 실시간, 민감한, 선택, 및 급속 한 탐지 필요한15,25입니다. 여기, 바이오 센서의 견고성 및 감도 기존의 방법, 특히, 보다 우량 하다. 전염 성 요원의 탐지를 위해 특히 살 균 소는 최근 그들의 호스트 박테리아 특이성33,,3435인 바이오 센서에 대 한 대체 biorecognition 요소로 간주 됩니다. 살 균 소와 항 체의 교체 비용을 절감 하 고 안정성 더욱36증가 매우 유망 하다. 이러한 시스템은 또한 검색 및 환경에 및 임상 견본에서 특정 페이지의 정량화에 허용 됩니다. 살 균 소, 그리고 그들의 능력을 박테리아와 항생제 저항 유전자37,38transduce의 보급으로 인해 그러한 방법 내성 박테리아의 확산을 공부 하 고 유용할 수 있습니다.

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

마리아 Baumgarten (IQ 바이오 플랫폼, 감염 의학, 룬 드 대학) 스캐닝 전자 현미경을 제공 하 고 수행에 대 한 인정 이다. 이 이는 이니셔티브의 일환으로는 유럽 제 3 공동 프로그래밍에 항균 성 저항 (JPIAMR) 전화 "전송 역학." 스웨덴 연구 위원회 Formas (2017-00100)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 Funders 연구 설계, 해석, 쓰기, 작품을 게시 하는 원고, 제출, 또는 의사 결정의 준비에 전혀 역할을 했다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass Cover slipsThermoFisher102222protein stamp
HClSigma-AldrichH1758-500MLcleaning
NaOHSigma-Aldrich72068-100MLcleaning
Ultrasonic cleanerBranson UltrasonicBRANSONIC M1800- Ecleaning
3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES)Sigma-AldrichA3648-100MLmodification
EtOHSigma-Aldrich1009836010rinsing/cleaning
glutaraldehydeSigma-AldrichG5882-100MLcross-linker
acetoneSigma-Aldrich34850-1L-Mcleaning
H2SO4Sigma-Aldrich339741-100MLpiranha solution
H2O2Sigma-AldrichH1009-500MLpiranha solution
tyramineSigma-AldrichT90344-5Gmodification
CompactStatIvium TechnologiesCompactStat.h: 30mA@10V/3MHzpotentiostat
Platinum Counter Electrode KitEquilabriumAFCTR5potentiostat
Reference ElectrodeEquilabriumRREF0021potentiostat
acryloyl chlorideEMD Millipore8.00826.0100modification
triethylamineEMD Millipore8.08352.0100modification
tolueneSigma-Aldrich244511-100MLmodification
N-hydroxymethyl acrylamideSigma-Aldrich245801-100Gfunctional monomer
poly ethylene glycol-400-dimethacrylateSigma-Aldrich409510-250MLcross-linker
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenoneSigma-Aldrich410896-50Gfunctional monomer
UV polymerizatorDymaxDymax 5000ECEUV-polymerization
forcepsSigma-AldrichZ168777-1EAconsumable
1-dodecanethiolSigma-Aldrich471364-100MLblocking agent
acrylamideSigma-AldrichA3553-100Gfunctional monomer
N-hydroxymethylacrylamideSigma-Aldrich245801-100Gfunctional monomer
N-isopropylacrylamideSigma-Aldrich415324-50Gfunctional monomer
methylenebisacrylamideSigma-Aldrich146072-500Gcross-linking monomer
N,N,N',N'-tetrametyhlethyldiamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281-25MLcatalyst
ammonium persulphateSigma-AldrichA3678-25Ginitiator
Capacitive biosensorCapSenzeEquipment
GlycineMerck1042011000regeneration buffer
Tween-20Sigma-AldrichP9416-50MLregeneration buffer
Trizma baseSigma-Aldrich93352-1KGrunning buffer
Na2HPO4 • 2H2OCalbiochem567547-1KGrunning buffer
NaH2PO4 • 2H2OCalbiochem567549-1KGrunning buffer
DELPHI correlative light and electron microscopePhenom-Worldequipment
Capacitive gold electrodesCapSenze Biosystemsconsumables
2,2'-azobis(2-methypropionitrile)Sigma-Aldrich441090-25Gphoto-initiator
CapSenze Smart SoftwareCapSenze Biosystemssoftware program

참고문헌

  1. Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor. Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).
  2. Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive Biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
  3. Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. P., Huo, Q. Predicting detection limits of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and bioanalytical techniques in general. The Analyst. 139 (2), 439-445 (2014).
  4. Mattiasson, B., Teeparuksapun, K., Hedström, M. Immunochemical binding assays for detection and quantification of trace impurities in biotechnological production. Trends in Biotechnology. 28 (1), 20-27 (2010).
  5. Limbut, W., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Capacitive biosensor for detection of endotoxin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (2), 517-525 (2007).
  6. Ertürk, G., Berillo, D., Hedström, M., Mattiasson, B. Microcontact-BSA imprinted capacitive biosensor for real-time, sensitive and selective detection of BSA. Biotechnology Reports. 3, 65-72 (2014).
  7. Arshady, R., Mosbach, K. Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization. Macromolecular Chemistry and Physics. 182 (2), 687-692 (1981).
  8. Andersson, L. I. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field. Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications. 745 (1), 3-13 (2000).
  9. Li, X., Husson, S. M. Two-dimensional molecular imprinting approach to produce optical biosensor recognition elements. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (23), 9658-9663 (2006).
  10. Alexander, C., Davidson, L., Hayes, W. Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis. Tetrahedron. 59 (12), 2025-2057 (2003).
  11. Kryscio, D. R., Peppas, N. A. Surface imprinted thin polymer film systems with selective recognition for bovine serum albumin. Analytica Chimica Acta. 718, 109-115 (2012).
  12. Inerowicz, H. D., Howell, S., Regnier, F. E., Reifenberger, R. Multiprotein immunoassay arrays fabricated by microcontact printing. Langmuir. 18 (13), 5263-5268 (2002).
  13. Lin, H. Y., Hsu, C. Y., Thomas, J. L., Wang, S. E., Chen, H. C., Chou, T. C. The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin. Biosensors and Bioelectronics. 22 (4), 534-543 (2006).
  14. Liao, P. C., Tyan, Y. C., Wang, C. Y., Hsu, J. F., Chou, T. C., Lin, H. Y. Assessing the binding selectivity of molecularly imprinted polymer artificial antibodies by mass spectrometry-based profiling system. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 91 (2), 597-604 (2009).
  15. Ertürk, G., Hedström, M., Tümer, M. A., Denizli, A., Mattiasson, B. Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors. Analytica Chimica Acta. 891, 120-129 (2015).
  16. Ertürk, G., Mattiasson, B. From imprinting to microcontact imprinting-A new tool to increase selectivity in analytical devices. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1021, 30-44 (2016).
  17. Ertürk, G., Mattiasson, B. Molecular Imprinting: The Creation of Biorecognition Imprints on Biosensor Surfaces. Advanced Molecularly Imprinting Materials. , 523-560 (2017).
  18. Janczuk-Richter, M., et al. Long-period fiber grating sensor for detection of viruses. Sensors and Actuators B: Chemical. 250, 32-38 (2017).
  19. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology. 501, 69-76 (2009).
  20. Meillan, M., et al. Self-assembled monolayer for AFM measurements of Tobacco Mosaic Virus (TMV) at the atomic level. RSC Adv. 4 (23), 11927 (2014).
  21. Ymeti, A., et al. Fast, ultrasensitive virus detection using a Young interferometer sensor. Nano Letters. 7 (2), 394-397 (2007).
  22. Wei, Y., Wong, L. P., Toh, C. -. S. Fuel cell virus sensor using virus capture within antibody-coated nanochannels. Analytical Chemistry. 85 (3), 1350-1357 (2013).
  23. Guliy, O. I., et al. Immunodetection of bacteriophages by a piezoelectric resonator with lateral electric field. Applied biochemistry and microbiology. 52 (4), 457-463 (2016).
  24. Reta, N., Michelmore, A., Saint, C., Prieto-Simón, B., Voelcker, N. H. Porous silicon membrane-modified electrodes for label-free voltammetric detection of MS2 bacteriophage. Biosensors & Bioelectronics. 80, 47-53 (2016).
  25. Ertürk, G., Özen, H., Tümer, M. A., Mattiasson, B., Denizli, A. Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 224, 823-832 (2016).
  26. Lebogang, L., Mattiasson, B., Hedström, M. Capacitive sensing of microcystin variants of Microcystis aeruginosa using a gold immunoelectrode modified with antibodies, gold nanoparticles and polytyramine. Microchimica Acta. 181 (9-10), 1009-1017 (2014).
  27. Loyprasert, S., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor. Biosensors & Bioelectronics. 25 (8), 1977-1983 (2010).
  28. Teeparuksapun, K., Hedström, M., Wong, E. Y., Tang, S., Hewlett, I. K., Mattiasson, B. Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen using nanofunctionalized surfaces in a capacitive immunosensor. Analytical Chemistry. 82 (20), 8406-8411 (2010).
  29. Labib, M., Hedström, M., Amin, M., Mattiasson, B. A capacitive biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (5), 1539-1544 (2009).
  30. Ertürk, G., Hedström, M., Mattiasson, B. A sensitive and real-time assay of trypsin by using molecular imprinting-based capacitive biosensor. Biosensors & Bioelectronics. 86, 557-565 (2016).
  31. Ertürk, G., Uzun, L., Tümer, M. A., Say, R., Denizli, A. Fab fragments imprinted SPR biosensor for real-time human immunoglobulin G detection. Biosensors & Bioelectronics. 28 (1), 97-104 (2011).
  32. El-Sharif, H. F., Phan, Q. T., Reddy, S. M. Enhanced selectivity of hydrogel-based molecularly imprinted polymers (HydroMIPs) following buffer conditioning. Analytica Chimica Acta. 809, 155-161 (2014).
  33. Wang, F., et al. Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors. Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).
  34. Chin, B. A., et al. Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors. 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).
  35. Park, M. -. K., Chin, B. A. Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil. Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).
  36. Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -. K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce. Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).
  37. Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples. Plos One. 6 (3), 17549 (2011).
  38. Lood, R., Ertürk, G., Mattiasson, B. Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle. Frontiers in microbiology. 8, (2017).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

132biomacromoleculemicrocontact

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유