Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Здесь мы описываем метод для очистки гистидин меткой pyrophosphokinase ферментов и используя тонкий слой хроматографии радиоизотопами субстратов и продуктов для анализа для ферментативной активности в пробирке. Assay активность фермента широко применима к любой киназы, циклазы нуклеотидов или реакции фосфора передача, механизм которого включает нуклеотидов трифосфата гидролиза.
Киназы и pyrophosphokinase ферменты передать фосфат гамма или бета гамма пирофосфат остаток от нуклеотида трифосфата прекурсоров субстратов для создания фосфорилированных продуктов. Использование γ -32- P пометкой прекурсоры NTP позволяет одновременный мониторинг использования и продукта формирования субстрата, рентгенография. Хроматографии (ТСХ) тонким слоем на пластины целлюлозы позволяет быстрое разделение и чувствительных количественной оценки субстрата и продукта. Мы представляем метод для использования тонкослойной хроматографии для анализа активности pyrophosphokinase очищенный синтетаза ppGpp (p). Этот метод использовался ранее для характеризовать деятельность циклических нуклеотидов и динуклеотид синтетаз и широко подходит для характеризующие активность фермента, который гидролизует Бонд трифосфата нуклеотидов или передает терминал фосфат с донором фосфатной к другой молекуле.
Киназы и pyrophosphokinase (или diphospho киназы) ферментов передать фосфатов из нуклеотидов трифосфата (NTP) прекурсоров молекулы субстрата. Подложки могут включать другие нуклеотиды, аминокислоты или белки, углеводы и липиды1. Bioinformatic анализы иногда можно предсказать фермента родственных субстрата или подложек, основанный на схожести с характеризуется ферментов, но по-прежнему необходима экспериментальная проверка. Аналогичным образом сходство фермент для его substrate(s) и скорость, с которой она катализирует реакцию люминофор передача и последствия сопутствующих факторов, ингибиторы, или другие фермента эффекторы должны быть определены экспериментально. Чтобы избежать истощение АТФ прекурсора других АТФ потребителями ферменты, присутствующие в цитоплазмой бактериальное, анализов количественных деятельности требуют очищенный протеин.
Очищение протеина хромотографией сродства металла тщательно охваченных литература2,3. Гистидин теги, состоящий из шести последовательных гистидина остатков, приложил к N - или C-конечная рекомбинантных белков позволяют быстрое очищение метал близость хроматографии4,5,6. Эти последовательности являются небольшими по сравнению с белками, они изменить и обычно имеют минимальное влияние на функции белка, хотя они могут иногда изменять стабильности белок фермента кинетики7,8. Гистидин теги в N - и C-Термини же протеина могут иметь различные эффекты, которые трудно предсказать, не зная структуры белка в вопросе. Гистидин теги обычно включаются во время клонирования рекомбинантных белков путем разработки грунты, которые кодируют шесть гистидина остатков, либо сразу 3' для начала кодон ГПТ или сразу 5' к стоп-кодон открытом чтения кадра. После усиления hexahistidine содержащие ген лигируют в вектор под контролем промотора индуцибельной и выразил, обычно в лаборатории штамм E. coli. Рекомбинация белок затем могут быть изолированы на близость смол, содержащих иммобилизованные двухвалентной катионов (обычно никель или кобальта)9. Загрязняя родной метал связывающих белков могут быть удалены путем титрования с имидазола, которое конкурсно вытесняет связанный протеин2. Наконец целевого белка этого eluted из столбца с более высокими концентрациями имидазола. Существует несколько коммерческих источников для иммобилизованных катиона металла смолы, и производители предоставляют рекомендации для буфера условий и концентрации имидазола. После элюции белка могут быть проанализирован натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE), dialyzed или сразу же использоваться в функциональных анализов.
Существует несколько способов косвенно контролировать активность протеинкиназы, связывая Бонд гидролиз АТФ фосфат второй реакции, которая выпускает или возбуждает Флюорофор или генерирует хемилюминесценции, но эти реакции имеют несколько движущихся частей и может быть технически сложных10. Наиболее простым способом конкретно измерить активность люминофор передача является непосредственно контролировать передачу radiolabeled фосфатной группы из коммерчески доступных γ -32-P предшественником NTP-radiolabeled субстрата11 , 12 , 13. смеси radiolabeled субстратов и продуктов могут быть разделены и количественно методом хроматографии (ТСХ) тонким слоем. TLC использует дифференциального мобильность растворенных веществ в данного растворителя, позволяя растворителя (жидкой фазы) для переноса капиллярность по всей поверхности (твердой фазы), после чего смесь растворов был адсорбированных14. Растворенных веществ, которые являются небольшими и/или отсутствие благоприятных взаимодействия с твердой фазы будет переносить большие расстояния от их первоначального расположения чем растворенных веществ с более высокой молекулярной массой или большой работоспособностью для тела. Для изучения люминофор передача фосфат постановление увеличить молекулярный вес молекул они добавляются и добавить отрицательный заряд ионных кислой или нейтральной рН11,12,14. Это снижает их мобильности на базовой поверхности, например Пей целлюлозы. Когда в кислой калия фосфатного буфера, смеси моно-, ди-, три-, тетра- и pentaphosphate видов могут быть легко разделены на ОПЭ целлюлозы, позволяя количественная оценка каждого вида (рис. 2, рис. 3). Такие анализы могут быть выполнены с помощью lysates клетки содержащие фермент интерес, но это включает в себя потенциал для деятельности других киназы, фосфатаз и общие ATPases к разрушающим субстрат или продукт. Для оценки количественных в vitro активность фермента необходимо очистить фермента интерес.
Гуанозина tetraphosphate (ppGpp) и pentaphosphate (pppGpp) гуанозина являются рибонуклеотид сигнальные молекулы, образованные передачи пирофосфат группа от прекурсор аденозинтрифосфатом (АТФ), соответственно, гуанозина дифосфат (ВВП) или гуанозина субстрата tetraphosphate (GTP)15. Эти сигналы одной рибонуклеотид, известные как ppGpp (p), посредником клетки широкий ответ экологического стресса, известный как строгие ответ в различных видов бактериальных,1516. Два сохранившихся классы ферментов катализируют образование (p) ppGpp15,17 Rel/Spo гомолога (RSH) ферментов являются «долго» бифункциональных (p) ppGpp синтетаза/гидролаз, назван в честь их сходство с реальными и SpoT (p) ppGpp метаболических ферменты от кишечной палочки , которые содержат синтетаза, гидролазы и нормативной областях, в то время как малые alarmone синтетазы (SAS) ферменты являются короткие монофункциональный синтетаз исключительно в грамм положительных бактерий15, 17 , 18. спорообразующих грамположительные бактерии Clostridium difficile кодирует предполагаемого RSH и SAS генов19. Здесь мы представляем первоначальный деятельность анализов, которые подтверждают, что фермент RSH C. difficile является каталитически активных синтетаза ppGpp (p).
1. индуцибельной гиперэкспрессия белка, гистидин тегами
2. белка очистки хромотографией сродства никеля
Примечание: Продолжите непосредственно с очистки белков, описанные ниже после уточнения lysate клетки. Хранение пояснил lysate при температуре 4 ° C на ночь для очистки последующие белка снижает урожайность белка.
3. белка деятельности пробирного хромотографией тонким слоем
Мы представляем метод очищения сродства синтетаза ppGpp (p) с Clostridium difficile и оценки ее Ферментативная активность. Рисунок 1 демонстрирует очищение протеина, достигнутые металла аффинной хроматографии. Вторая фракция элюции (E2) от этого очищения был dialy...
Здесь мы приводим очистки его меткой RSH от C. difficile и представит метод количественной оценки деятельности с использованием хроматографии radiolabeled тонким слоем. Этот метод использовался ранее для оценки активности ферментов циклазы diguanylate C. difficile, а также синтетаза ppGpp (p), циклазы ?...
Авторы заявляют, что без финансовых интересов или другие конфликты интересов.
Эта работа финансировалась NIAID 1K22AI118929-01. EBP была поддержана летом исследовательский грант программы стипендий от управлением исследований в университете старого Доминиона, Норфолк, Виргиния, США.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | - | |
Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | - | |
MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | - | |
Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 μm thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | - |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены