정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한

요약

여기, 히스티딘 태그 pyrophosphokinase 효소 정화 및 radiolabelled 기질 그리고 효소 활동 체 외에 대 한 분석 결과를 제품의 얇은 층 크로마토그래피를 이용 하는 방법을 설명 합니다. 효소 활동 분석 결과 모든 키, 뉴클레오티드 있고, 또는 인광 체 전송 반응의 메커니즘 포함 뉴클레오티드 3 인산 염 가수분해에 광범위 하 게 적용 됩니다.

초록

키 및 pyrophosphokinase 효소 phosphorylated 제품을 기판에 뉴클레오티드 3 인산 염 선구자에서 감마 인산 염 또는 베타-감마 파이 인산 moiety를 전송. 사용 하는 γ-³²-P NTP 선구자를 표시 하실 수 있습니다 방사선에 의해 기판 사용률 및 제품 대형의 동시 모니터링. 셀 룰 로스 판에 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 신속한 분리 및 기질과 제품의 민감한 정량화를 허용 한다. 우리는 얇은 층 크로마토그래피 정제 (p) ppGpp 합성의 pyrophosphokinase 활동 분석 결과를 활용 하는 방법을 제시. 이 방법은 주기적인 뉴클레오티드 및 디뉴클레오티드 synthetases의 활동 특성 사용 되었습니다 이전 이며 뉴클레오티드 3 인산 염 유대 hydrolyzes 또는 터미널 전송 하는 모든 효소의 활동을 특성화 하는 데 광범위 하 게 적합 인산 다른 분자를 염 인산 염 기증자 로부터

서문

키 및 pyrophosphokinase (또는 diphospho 키) 효소 기질 분자 뉴클레오티드 3 인산 염 (NTP) 선구자에서 인산 염을 전송. 기판 다른 뉴클레오티드, 아미노산 이나 단백질, 탄수화물, 그리고 지질¹포함할 수 있습니다. 효소의 동족 기판 또는 특징이 효소를 유사성에 따라 기판 Bioinformatic 분석 예측 가끔 수 있습니다 하지만 실험 유효성 검사 여전히 필요 합니다. 마찬가지로, 그것의 substrate(s) 및는 그것 catalyzes 형광체 전송 반응 속도 효소의 선호도 및 공동 요인, 억제제, 또는 다른 효소 이펙터의 효과 결정 되어야 합니다 실험적으로. 다른 ATP 소모 효소 세균성 세포질에 존재에 의해 ATP 전조의 소모를 피하기 위해, 양적 활동 분석 실험 순화 된 단백질을 필요로 합니다.

단백질 정화 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 문학^2,3에 철저 하 게 적용 되었습니다 했습니다. 히스티딘 태그 6 연속 히스티딘 잔류물에는 N-또는 C-말단 재조합 단백질의 추가 구성 된 금속 친화성 크로마토그래피^4,,56에 의해 급속 한 정화를 수 있습니다. 이러한 시퀀스는 작은 그들은 때로는 단백질 안정성 및 효소 반응 속도 론^7,8변경할 수 있지만 그들은 수정 하 고 일반적으로 단백질 기능에 미치는 영향을 최소화 하는 단백질에 비해. 히스티딘 태그에는 N-와 C-테르미니 같은 단백질에 단백질의 구조를 알지 못하고 예측 하기 어려운 다양 한 효과 가질 수 있습니다. 히스티딘 태그는 일반적으로 복제는 재조합 형 단백질의 중 즉시 6 히스티딘 잔류물, 인코딩할 뇌관을 설계 하 여 3' ATG 시작 codon에 또는 즉시 5', 열려있는 독서 프레임 정지 codon를 하는 동안 통합 된다. 증폭 후 포함 하는 hexahistidine 유전자는 유도할 수 있는 발기인의 통제 벡터에 출혈 이며 표현 하는, 일반적으로 대장균의 실험실 긴장에. 재조합 단백질 다음 고정된 divalent 양이온 (일반적으로 니켈 또는 코발트)⁹를 포함 하는 선호도 수 지에 고립 될 수 있다. 기본 금속-바인딩 단백질 오염 하는 것은 이미, 경쟁적으로 바인딩된 단백질²배 수량으로 적정 하 여 제거할 수 있습니다. 마지막으로, 대상 단백질은 eluted 이미의 높은 농도와 열에서. 고정된 금속 양이온 수 지에 대 한 몇 가지 상용 소스 고 버퍼 조건 및 이미 농도 대 한 권장 사항을 제공 하는 제조 업체. 차입, 후 단백질 수 수 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분석, dialyzed, 또는 기능 분석에서 즉시 사용.

해제 또는 fluorophore는 흥분 하거나 생성 하는 화학, 두 번째 반응에 ATP 인산 염 결합 가수분해를 커플링 하 여 키 니 아 제 활동을 직접으로 모니터링 하는 여러 가지 방법이 있습니다 하지만이 반응은 여러 이동 부분 그리고 될 수 있는 물류 도전¹⁰. 특히 형광체 전송 활동을 측정 하는 가장 간단한 방법은 모니터링 하는 데 직접 상용 γ-³²에서 방사선된 인산 염 그룹의 전송-P 비 방사선 기판¹¹ 에 NTP 전조 ^{, 12 , 13}. 방사선된 기판 및 제품의 혼합물을 분리 하 고 얇은 층 크로마토그래피 (TLC)에 의해 측정할 수 있다. TLC 용 매 (액체 단계) 모 세관 작용에 의해 표면 (단단한 단계)는 용액의 흡착된¹⁴되었습니다에서 마이그레이션할 수 있도록 하 여 주어진된 용 매에서 용액의 차동 이동성을 활용 합니다. 있는 작은 고체 단계와 호의 베푸는 상호 작용 부족 용액 마이그레이션됩니다 높은 분자 무게 또는 고체에 대 한 대단한 선호도 용액 보다 더 긴 거리 그들의 초기 위치에서. 인 전송의 시험, 인산 moieties 그들에, 추가 되 고 중성 또는 산 성 pH^11,,1214에서 부정적인 이온 충전 추가 분자의 분자량 증가. 이 페이 셀 룰 로스 등 기본 표면에 그들의 기동성을 감소합니다. 신랄 한 칼륨 인산 염 버퍼에서 개발, 페이-셀 루 로스, 각 종 (그림 2, 그림 3)의 정량화를 허용에 모노, 디, 트라이-, tetra-및 pentaphosphate 종의 혼합물을 쉽게 분리 수 있다. 이러한 분석의 관심, 효소를 포함 하는 세포 lysates를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 하지만이 다른 kinases, 가수분해, 및 일반적인 ATPases의 활동에 대 한 잠재력을 고갈 기판 및/또는 제품을 포함 합니다. 평가 대 한 양적 체 외에서 효소 활동의, 그것은 관심의 효소 정화 해야 합니다.

Guanosine tetraphosphate (ppGpp) 및 guanosine pentaphosphate (pppGpp)는 ribonucleotide 신호 분자는 파이 인산의 이동에 의해 형성 된 그룹 아데노신 3 인산 염 (ATP) 전조에서 각각, guanosine diphosphate (GDP) 또는 guanosine tetraphosphate (GTP) 기판¹⁵. 이러한 단일 ribonucleotide 신호, (p) ppGpp로 총칭 알려진 다양 한 세균성 종^15,16에 엄격한 응답으로 알려진 환경 스트레스에 셀 전체 응답 중재. 두 가지 보존된 수준의 효소 촉매 형성 (p) ppGpp^15,17 Rel/Spo의 체 (RSH) 효소는 '긴' bifunctional (p) ppGpp 합성/hydrolases 휴식 자리 (p)를 그들의 유사성에 대 한 명명 된 ppGpp 신진 대사 대장균 에서 합성, 가수분해 효소, 및 규제 도메인, 작은 alarmone (SAS) 합성 효소는 짧은 monofunctional synthetases 그램 긍정적인 박테리아^15, 에서 독점적으로 포함 하는 효소 ^{17 , 18}. 포자 형성 그람 양성 박테리아 클로스 트리 남과 어울리지 않 는 putative RSH 및 SAS 유전자¹⁹인코딩합니다. 여기, 선물이 C. 남과 어울리지 않 는 RSH 효소 촉매로 활성 (p) ppGpp 합성 인지 확인 하는 초기 활동 분석 실험.

프로토콜

1. 유도할 수 있는 Overexpression 히스티딘 태그 단백질의

1. Rsh C. 남과 어울리지 않 는 R20291 genomic DNA에서에서 증폭.
   1. 높은 중 합 효소를 사용 하 고 제조업체의 지침을 따르십시오.
   2. C. 남과 어울리지 않는 rsh 뇌관을 사용 하 여 증폭
      rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG)와
      rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), C 터미널 hexahistidine 태그를 소개 하.
      참고: KpnI와 PstI 사이트 뇌관 순서에 잘라 굵게 표시 됩니다.
   3. PMMBneo 벡터 소화 그리고 rsh his6 PCR 제품 Pstl 및 KpnI 제한으로 45 분 동안 37 ° C에 사이트.
   4. 선형화 벡터와 PCR 파편 agarose 젤 전기 이동 법 및 DNA 젤 추출 키트와 함께 후속 정화를 통해 정화.
   5. 280 nm의 흡수도 (₂₈₀)는 벡터 및 증폭 된 PCR 제품을 측정 합니다. 방정식을 사용 하 여 각 DNA 조각의 DNA 농도 결정 하.
2. PMMBneo 식으로 rsh 를 선.
   1. 소화 PMMBneo 벡터, 125의 결합 25 ng ng rsh his6 유전자 제품, 리가 버퍼, x 10의 2 μ 및 DNA 리가의 1 μ. Nuclease 무료 물을 사용 하 여 20 μ에 총 볼륨 조절. 16 h 16 ° C에서 품 어.
      참고: 결 찰의 효능 그리고 조각 크기에 따라 제조 업체 프로토콜에 따라 조정 해야 합니다.
   2. 대장균 DH5-α 또는 다른 recA- 플라스 미드 유지 보수 부담으로 합자 벡터 제품을 변환. 100 μ g/mL 대 파운드 접시에 변환 된 셀에 대 한 선택 하 고 37 ° c.에서 16-24 h에 대 한 품 어
   3. 변환 플레이트 (s)에서 4 개의 식민지를 선택 하 고 각 100 μ g/mL 대 DNA 격리를 포함 하는 신선한 접시에 행진. 16-24 h에 대 한 37 ° C에서 새로운 번호판을 품 어 고 후속 단백질 식에 대 한 분리를 선택 합니다.
   4. 확인 하려면 지역 코딩 그대로 rsh 단백질의 성공적인 결 찰, 선택 선택의 식민지, 물 20 μ로 격리 10 분 동안 95 ° C에가 열 하 고 확실 한 PCR 유전자를 증폭 하는 데 사용 하는 동일한 뇌관을 사용 하 여 템플릿으로 사용 합니다.
3. 고수익 단백질 생산을 위한 대장균 BL21 시스템으로 대장균 세균성 플라스 미드 전이 대 한 표준 변환 프로토콜에 따라 확인 된 플라스 미드를 변환.
4. 대장균에서 RSH-His6 익스프레스.
   1. PMMBneo로 변형 대장균 BL21의 단일 식민지를 선택::rsh 50 μ g/mL 대와 파운드 매체의 2 개 mL를 접종 하 고. 37 ° C에서 품 어 12-16 h 250 rpm에서 떨고 있는 동안.
   2. 고 단백질 식 숙박 문화의 0.5 mL와 함께 50 μ g/mL 대를 포함 하는 파운드 매체의 500 mL 접종
   3. 셀 밀도는 OD₆₀₀ 0.167 37 ° c.에 도달할 때까지 37 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 250 rpm에서 식 문화를 품 어
   4. 인큐베이터 온도 30 ° C를 감소 시키십시오 하 고 드롭 문화 온도 대 일 분을 기다립니다.
   5. 0.5 m m의 최종 농도에 이소프로필 β-D-thiogalactoside (IPTG)를 추가 하 여 RSH 식 유도. 유도 250 rpm 동요 30 ° C에서 하룻밤 (h를 위한 16-18) 자리를 차지할 수 있습니다.
   6. 4 ° c.에 30 분 동안 3,080 x g에서 원심 분리 하 여 펠 렛
      참고: 펠 릿 정화 대상 단백질 단백질 수확량 또는 효소 활동의 눈에 띄는 손실 없이 다음 날-20 ° C에서 하룻밤 저장할 수 있습니다.

2. 단백질 정화 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해

참고: 직접 세포 lysate를 명확히 후 아래 제공 된 단백질 정화 단계 계속 합니다. 저장 명확히 lysate 4 ° C에서 하룻밤 후속 단백질 정화 단백질 수확량 감소.

1. 니켈-Nitriloacetic 산 (Ni-NTA) 수 지의 1 mL를 사용 하 여 중력 열에 단백질 정화.
   1. 하루 전에 사용 하 여, 재래식 버퍼 (10 mM Tris HCl pH 7.79, 300 m m NaCl, 50mm NaH₂포₄, 0.5 mg/mL lysozyme, 5 mM MgCl₂, 이미 10 m m, 0.25 m m 5 mM phenylmethane sulfonyl DTT의 2 mL와 4 ° C에서 하룻밤 열 equilibrate 불 소 (PMSF), 10% 글리세롤).
   2. 다음 날 열가지고 명확히 하기 전에 rt 4 ° C에서 lysate와 서 ~ 2-3 h.
      참고: 열 평형에 데 열은 열 내에서 형성 하는 기포를 피하기 위해 중요 합니다.
   3. 1.3.6 세포의 용 해 버퍼 (10 mM Tris HCl pH 7.8, 300 m m NaCl, 5 mM MgCl₂, 50mm NaH₂포₄, 10% 글리세롤, 0.5 mg/mL lysozyme, 10mm 이미, 0.25 mM DTT와 5 밀리미터 PMSF)에 단계에서 얻은 펠 릿 resuspend
   4. 8 x 10 s 간격으로, 30 일시 중지에 대 한 얼음에 셀 sonicate 펄스 사이 s.
   5. 명확히는 lysate를 microcentrifuge를 사용 하 여 4 ° C에서 30 분 동안 3,080 x g에서 원심 분리.
   6. 세포의 용 해 버퍼의 동등한 양으로 lysate 준비 다음 적용를 준비한 열 lysate 명확히 하 고 흐름 통해 수집.
   7. 명확히 lysate 자형 열에 다시 적용 하 고 보조 흐름 통해 수집 합니다.
   8. 워시 워시 버퍼 1 (10 mM Tris HCl (7.79 pH) 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 m m NaH₂포₄, 30 mM 이미 10% 글리세롤) 열. 흐름 통해 수집 합니다.
      참고: 세척 및 차입 버퍼에서 5 mM MgCl₂ 의 순화 된 단백질의 효소 활동에 대 한 중요 하다.
   9. 워시 워시 버퍼 2 (10 mM Tris HCl (7.79 pH) 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 m m NaH₂포₄ 와 50 m m 이미) 열. 흐름 통해 수집 합니다.
   10. 2 mL 차입 버퍼 (10 mM Tris-HCl (7.79 pH) 300 m m NaCl, 50mm NaH₂포₄, 10% 글리세롤과 75mm 이미)를 적용 합니다. 1 mL의 두 분수에서 흐름 통해 수집 합니다.
       참고:이 단계를 수행한 후 열 경우 동일한 단백질 다음 정화 분석 결과에 순화 될 것 이다 4 ° C에서 재래식 버퍼에 저장할 수 있습니다. 열 제대로 저장 하는 경우 최대 3 번까지 사용할 수 있습니다.
2. SDS 페이지 순도 대 한 열 분수를 평가 합니다.
   1. 단백질 정화는 질적 평가, 170 V에서 60 분 동안 4%/10 %polyacrylamide 젤에 모든 열 분수의 20 μ aliquots를 실행 합니다.
   2. 벤치탑 로커에 부드럽게 락 5 h에 대 한 실 온에서 0.1 %Coomassie 파란 젤 얼룩.
   3. 40% 메탄올, 벤치탑 로커에 락 실 온에서 하룻밤 10% 빙 초 산에에서 젤 destain
      참고: 대표적인 젤은 그림 1에서 그림입니다.
3. Dialyze 분수 2 4 ° c.에 하룻밤을 elute
   1. 200: 1 비율 20 kDa 분자량 컷오프 (MWCO)와 함께 1 mL 투 석 장치를 사용 하 여 투 석 버퍼 (15.7 m m Tris HCl (pH 7.6), 471.9 m m NaCl, 15.69 m m MgCl₂, 1.57 m m DTT, 1.5 밀리미터 PMSF, 15.7% 글리세롤)에 대 한 dialyze.
   2. 280에서 흡 광도 측정 하 여 dialyzed 단백질 샘플의 농도 결정 및 사용 하 여 계산 된 어 금 니 소멸 계수 82085 M^-1c m^{-1 20}.
   3. 사용까지-80 ° C에서 aliquots에 dialyzed 단백질 샘플의 5 μ aliquots를 저장 합니다.

3. 단백질 활동 분석 결과 얇은 층 크로마토그래피에 의해

1. 얇은 층 크로마토그래피 접시를 준비 합니다.
   1. 반응 하기 전에, 준비 polyethyleneimine (페이)-이온된 물에 세척 하 여 셀 룰 로스 판. 두 배 증류수 ~0.5 cm의 깊이 유리 챔버에 접시를 놓습니다.
   2. 물 접시의 상단에 마이그레이션할 수 있습니다.
      참고: 엄격 하 게 필요 하 고, 번호판 없이, 사용할 수 있습니다 하지만 세척 결과 이미지의 선명도 증가 하는가 격판덮개를 세척. 2 개의 수직 방향 더에서 격판덮개를 세척 접시 (그림 2)의 한 구석에 어떤 오염 물질 수 지에 격리 됩니다 보장 합니다.
   3. 유리 챔버 밖으로 접시를 가져오고 건조 하룻밤 (12-18 h) 벤치탑 선반에 두고.
   4. 어디 샘플 TLC 적용 됩니다 나타내는 부드러운 연필로 건조 접시 한쪽 가장자리에서 2.0 c m를 표시 합니다. 2 μ 샘플에 대 한 적용 샘플 보다 1.0 c m 간격 (그림 2).
      참고:이 신호 정량화에 대 한 중요 한 인접 한 자리 사이의 명확한 분리 수 있습니다. 셀 루 로스 수 지는 긁힌, 작은 표면에 연필 자국 용 마이그레이션 방해 하지 않습니다.
   5. 실험을 계획할 때 항상 한 자리에 두고 각 플레이트 사용 하지 않는.
      참고:이 샘플 정량화 (그림 2)에 대 한 빈 레인을 제공 합니다. 20 cm TLC 판 19 관광 명소에 대 한 공간이 됩니다.
2. 효소 활동 분석 결과
   1. 50 mM Tris HCl (pH 7.5), 25mm 암모늄 아세테이트, 10mm KCl, 1mm DTT와 0.6 m m ATP 포함 하는 5 x 버퍼 믹스를 준비 합니다.
      참고:이 혼합 대량에서 준비 고 나중 사용을 위해 10 μ aliquots에 동결 될 수 있습니다. 여러 freeze-thaw 주기를 믹스를 적용 하지 마십시오.
   2. 3 μ RSH, 버퍼 믹스 1 개, 0.6 m m GDP, 1.2 m m MgCl₂를 포함 하는 개별 반응 준비. Γ-³²P-ATP 당 반응의 10 μ의 1.0 μCi를 추가 하 고 nuclease 무료 물을 사용 하 여 원하는 볼륨까지 반응 하기. RSH의 뉴클레오티드를 포함 하는 혼합 뿐만 아니라 효소 활동 분석 결과 시작으로 다른 구성 요소, 혼합 후는 RSH 추가 합니다.
      참고: 최종 반응 볼륨 timepoints 샘플링의 수에 따라 달라 집니다. 2 μ/timepoint 샘플, 10 μ 각 4 timepoints에 대 한 반응 혼합물의 조립.
   3. 오염 nuclease 활동에서 ATP 가수분해에 대 한 제어, 조립 10 μ 반응 없는 단백질을 포함 하 고 동시에 품 어. T 2 μ 샘플 자리 0 = ATP 단백질 결핍에서 분해 하지는 보장 하기 위해 실험의 끝에.
   4. 즉시 RSH의 추가, 시 2 μ를 제거 하 고 t로 레이블이 지정 된 페이 셀 루 로스 접시에 자리 = 0 분 샘플.
   5. 원하는 timepoints에서 2 μ aliquots를 제거 하는 37 ° C에서 반응을 품 어.
      참고: 효소 활동 샘플 셀 루 로스 판에 흡착 될 때 중단 됩니다. 마지막 자리는 완전 한 흡착 및 샘플 건조 되도록 개발 전에 접시에 추가 됩니다 후 10-30 분을 기다립니다.
3. 얇은 층 크로마토그래피
   1. 크로마토그래피 챔버를 1.5 M 1.5 M KH₂포₄ (pH 3.64) 0.5 cm의 깊이 채워 넣어 라.
      참고: 볼륨 필요한 크로마토그래피 탱크의 크기에 따라 달라 집니다. 굽 힘 없이 TLC 판의 삽입을 허용 하도록 충분히 넓은 수준 바닥 유리 컨테이너 개발 탱크 커버의 추가 함께 사용할 수 있습니다. TLC 판 플라스틱 필름으로 덮여 유리 비 커에 개발을 활성화 하는 깨끗 한 razorblade로 좁은 스트립으로 잘릴 수 있다.
   2. 용 매에 접시의 아래쪽 가장자리를 담가. 용 플레이트 (~ 90 분)의 상단에 마이그레이션할 수 있습니다.
      참고: 동안 용 마이그레이션 판의 상단에 멈추게 되 고 샘플 또는 분실 될 하지 더 이상 침수 동안 함께 실행, 접시 안 맡겨야 한다 용 매에서 하룻밤. 4h 이상 침수 백업 플레이트에서 분리 하 여 신호 손실 될 수를 발생할 수 있습니다.
   3. 크로마토그래피 탱크에서 접시를 제거 하 고 건조 랙 벤치탑에 배치.
   4. 공기 접시를 허용 하룻밤 건조 합니다.
      참고: 건조 헤어 드라이어를 사용 하 여 가속 수 있습니다. 건조는 젖은 때 어두워질 것 이다 수 지와 완전히 건조 때 사용 하지 않는 접시의 색상으로 돌아갑니다의 색상에 의해 평가 될 수 있습니다.
   5. 접시 건조 후 랩 autoradiography (그림 3)에 의해 분석을 이미징 카세트에 방사성 물질의 양도 피하기 위해 플라스틱 필름에 접시.
4. 데이터 분석
   1. 실 온에서 4 h phosphorimager 카세트를 분리 된 반응을 포함 하 페이 셀 룰 로스 판 노출.
      참고: 이것은 신선한 γ-³²P-ATP의 표시 농도 사용 하 여 매우 깨끗 한 이미지를 충분 한 노출. Radiolabelled 기판의 낮은 양을 사용 하는 경우 12-16 h에 노출 시간을 늘릴 수 있습니다.
   2. 이미지는 phosphorimager에 카세트입니다.
   3. 그릴 사각형 을 선택 하 고 약 한 전체 레인과 ATP ppGpp 관광 명소 그 레인 (그림 3에 포함 된 직사각형 ROIs를 그리는 마우스를 사용 하 여 관심 영역 (ROIs) 그릴 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 그래픽 사용자 인터페이스와 함께, ).
   4. 선택, 복사 및 붙여넣기 명령 (또는 사용 중인 이미징 소프트웨어에 따라 해당 명령)를 사용 하 여는 ROIs 각 차선에서 동일 지역 내에서 신호를 측정 하는 보장 하기 위해 다른 차선 내에서 동일한 ROIs를 그릴. 공란으로 사용할 수 있는 사용 하지 않는 차선에서 ROIs를 포함 합니다.
   5. 분석은 를 사용 하 여 | 도구 | 투자 수익 관리자 | 추가 이미징 소프트웨어의 명령을 모든 페이 셀 룰 로스 판에 그려진 ROIs을 선택.
   6. 분석은 를 사용 하 여 | 측정을 설정 | 측정 명령, 각 ROI 내에서 신호 강도 계량 및 스프레드시트 (그림 3)으로 측정을 내보낼. 실험 신호에서 빈 ROI 값을 뺍니다.
   7. ATP와 수식을 사용 하 여 ppGpp에 기인 각 차선 내에서 숨겨진된 신호의 비율을 계산
      참고: ROIs 얻을 수 있습니다 및 quantitated 상용 소프트웨어는 phosphorimager와 호환 또는 자유롭게 사용할 수 ImageJ 소프트웨어 (국립 보건원)를 사용 하 여.

결과

선물이 Clostridium 남과 어울리지 않는 그것의 효소 활동의 평가에서 (p) ppGpp 합성의 친 화력 정화 하는 방법. 그림 1 에 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 달성 단백질 정화 방법을 보여 줍니다. 이 정화에서 두 번째 차입 (E2) 분수 dialyzed 고 효소 활동 분석 결과 대 한 사용. 그림 2 에 대 한 준비 하 고 얇은 층 크로마토그?...

토론

여기 우리가 보고 그의 태그 RSH C. 남과 어울리지 않 는에서 정화 활동 정량화 방사선된 얇은 층 착 색 인쇄기를 사용 하 여에 대 한 방법을 제시 하 고. 이 방법은 이전 C. 남과 어울리지 않는로 (p) ppGpp 합성, 뉴클레오티드 있고, 키 니 아 제 diguanylate 있고 효소와 다른 유기 체^{11,12 포스 효소의 활동을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. ,}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inducible overexpression of a histidine-tagged protein
Phusion polymerase	New England Biolabs (NEB)	M0530L
QIAEX II DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	20021
KpnI restriction enzyme	NEB	R0142S
PstI restriction enzyme	NEB	R0140S
T4 DNA ligase	NEB	M0202
NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987I
BL21 (DE3) Competent E. coli	NEB	C2527I
IPTG	Sigma-Aldrich	10724815001
JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor	Beckman Coulter Avanti	-
Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor	Scilogex	-
MaxQ SHKE6000 Incubator	Thermo Scientific	-
Ultrasonic processor	Sonics	VC-750
Protein purification by nickel affinity chromatography
Ni-NTA resin	G Biosciences	786-940/941
Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL	Thermo Scientific	29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD)	Spectrum	G235033
Mini-Protean Electrophoresis Cell	BioRad	1658004
Protein activity assay by thin layer chromatography
Thin layer chromatograph (TLC) development tank	General Glass Blowing Company	80-3
Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 μm thickness) with polyester support	Sigma-Aldrich	Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi	Perkin Elmer	NEG002A
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM	Bio Basic Canada	AB0311
Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP)	Alfa Aesar	AAJ61646MC/E
Storage phosphor screen	GE Healthcare Life Sciences	BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen
Storm 860 phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	-