Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
Предоставление одноклеточных чувствительность, реального времени проточной цитометрии однозначно подходит для количественного определения смешанных рецепторных функций живых культур. С использованием клеток взрослых нейронных прародителю, функция рецептора P2X7 оценивалось через приток кальция, обнаруженных кальция индикатор краситель, трансмембранного порообразования поглощения бромид ethidium, и фагоцитоз, с использованием флуоресцентных латексные шарики.
Для количественной оценки биологических процессов в живых клеток проточной цитометрии все шире используется среди клеточных биологов клеточные культуры. Этот протокол описывает метод whereby клеток проточной цитометрии продлевается после анализа многочисленных функций активации рецептора P2X7 в режиме реального времени. С помощью модуля времени, установленных на проточный цитометр, жить клеточной функциональность можно оценивать и заговор за определенный период времени для изучения кинетики приток кальция, трансмембранного порообразования и фагоцитоз. Этот простой метод является выгодным, поскольку все три канонические функции рецептора P2X7 могут быть оценены с использованием одной машины, и собранные данные на печать со временем предоставляет информацию о совокупности клеток, а не одноклеточных записи часто полученные с помощью технически сложных методов патч зажим. Эксперименты приток кальция использовать индикатор краска кальция, P2X7 поры формирования assays полагаются на бромид ethidium, разрешается пройти через трансмембранного поры сформированных по концентрации высокой агониста. Желто зеленый (YG) латексные шарики используются для измерения фагоцитоза. Конкретные агонистов и антагонистов применяются для изучения последствий деятельности P2X7 рецепторов. Индивидуально эти методы могут быть изменены представить количественные данные о любое количество кальциевых каналов и рецепторов purinergic и падалью. Взятые вместе, они подчеркивают, как использование в реальном времени живой клетки проточной цитометрии является быстрое, экономически эффективным, воспроизводимые и количественному методом расследовать P2X7 рецептор функции.
Изучение purinergic сигнализации является широкая и многогранная, с участием клеточной физиологии, биохимии и фармакологии. Purinergic сигнализации участвует в бесконечное количество клеточных и молекулярных процессов, от рака и регуляции клеточного цикла в ячейке коммуникаций и биологии стволовых клеток; Таким образом часто существует потенциал для модуляции purinergic сигнализации для терапевтический эффект. Purinergic рецепторов P2X7 рецептор получила значительное внимание в последние годы из-за ее потенциал как терапевтические мишенью для многочисленных воспалительных процессов1. Методы для изучения рецептор развивалась и была адаптирована с годами для облегчения этого исследования2,3,4,5. Здесь мы описываем метод цитометрии клеток потока для расследования многочисленных функций P2X7 рецепторы в клетках взрослых нейронных прародителю, полученных из субвентрикулярной зоны (SVZ) и зубчатой извилине гиппокампа.
Рецептор к P2X7 был впервые описан как с P2Z рецепторами, или «смерть клетки»-рецептор, как ее активации с высокой концентрацией аденозина трифосфата (АТФ) приводит к образованию большого трансмембранного поры проницаемой для молекул до 900 да6. Это приводит к цитоскелета перегруппировки, трансмембранного порообразования и, потенциально, apoptosis and/or некроз7. Традиционно эта функция P2X7 количественно путем поглощения красители большой молекулярный вес как YO-PRO-1 или ethidium бромид, которые флуоресцировать когда интеркалированного с ДНК3,8. Пластина чтения методы, которые являются быстрое и позволяют для масштабирования, как правило не позволяют для наблюдения за кинетики. Метод, описанный здесь основан на поглощении ethidium и позволяет увеличить флуоресценции соблюдаться со временем, обеспечивая большую глубину информации в отношении скорости порообразования. С тех пор было показано P2X7 рецепторов, облегчить ряд nonimmune функций, с различных ответов в зависимости от воздействия времени и агонист концентрация9,10. Краткое активации по более низкой концентрации ATP результаты в катионной приток для целей трансдукции медиатора и сигнала11. С помощью проточной цитометрии для измерения приток кальция преодолевает проблемы, связанные с громоздким и технически сложные методы — особенно, патч зажима для измерения внутрь токи, которые обеспечивают неоценимую детали относительно изменения в потенциал через клеточной мембраны, но не позволяют проводить анализ населения2. Третья функция P2X7 рецепторов происходит в отсутствие АТФ, где было продемонстрировано облегчения фагоцитоза в иммунной системы и нервной системы9,12,13P2X7 рецепторов. Усовершенствования в методы микроскопии позволили визуализации цитоскелета перестановок во время процесса поглощения, хотя анализ количественной оценки и населения могут по-прежнему представляют собой проблему.
Метод потока клеток цитометрии подробно здесь позволяет для расследования всех трех основных функций P2X7 рецепторов в режиме реального времени. Включение модуля устройства время на проточный цитометр позволяет контроля температуры и постоянно помешивая клеток в суспензии. Агонистов и антагонистов стимулы могут быть доставлены в течение секунды, позволяя почти непрерывное измерение клеточного ответа. Это предоставляет быстрый и простой метод для герметизации количественную оценку функции избегая использования нескольких систем анализа. Важно отметить, что этот протокол может быть легко адаптирована для удовлетворения любой тип клеток и могут быть использованы для изучения другие подтипы рецепторов, учитывая включение конкретных агонистов или ингибиторы, в зависимости от их свойств.
Животные были обращались в соответствии с австралийским кодекса практики для ухода и использование животных для научных целей и одобрены для использования Комитетом по этике животных университет Гриффит.
1. нейросферы культура нейронных прогениторных клеток от взрослых SVZ и гиппокампа
Примечание: Протокол вскрытия, представленные здесь основан на работе Уокер и Kempermann, и подробный протокол для рассечения нейронных прогениторных клеток от взрослых мышей доступен других14. Бабу и коллеги15были изменены условия культуры. Были использованы взрослых самок мышей C57BL/6, в возрасте 8-12 недель.
2. подготовка одной ячейки подвеска для анализа проточной цитометрии
3. Измерение приток кальция потоком цитометрии Live клеток
4. Измерение порообразования подачей Cytometry клеток
5. Измерение фагоцитоза, жить клеточной проточной цитометрии
6. анализ данных
Культуры клеток нейронной прародителя
Нейронные прародитель сферы культуры, полученных с помощью этого метода следует фаза светлые и имеют гладкие круглые края (рис. 1AB). В здоровых культур малые microspikes можно наблюдать на края (рис. 1 c). В конце ходы или если недостаточно кормили, сферах могут образовывать полые Чашечная форма (рис. 1 d) или крупные продолговатые формы (Рисунок 1E, указано стрелкой). Эти культуры не должны использоваться для проточной цитометрии или любые другие нисходящие приложения, как эти функции оно может свидетельствовать о дифференциации. Для подтверждения статуса нейронных прародителю, клетки были покрытием на стекло coverslips покрытием с поли L-орнитин и Ламинин immunocytochemistry (Рисунок 1F и, в более высоких confluency, Рисунок 1 g). Клетки окрашивали для СВМС, Нестин, Sox2, виментин, ASCL1, BLBP, Prox1 и DCX для идентификации клетки клетки-предшественники типа 2 (гиппокамп) или типа C прогениторных клеток (SVZ)9. Клетки должны иметь четко определенные ядро и расширенных процессов.
Рисунок 1: представитель гиппокампа нейронных прародитель клеточной культуры. (A) гиппокампа прародитель нейронные клетки изолированы от взрослых мышей и культивировали как neurospheres до примерно 100-150 мкм в диаметре. (B) Neurospheres должен иметь гладкую периферии, (C) и малых microspikes может быть замечен на их поверхности. Когда сферы являются слишком долго в культуре, они могут образовывать Кубок (D) или (E) продолговатой формы. Эти культуры не должны использоваться для экспериментов. Для подтверждения статуса нейронных прогениторных клеток, семя их как одну ячейку подвеска на поли L-орнитин (ООП) и coverslips Ламинин покрытием стекла для Иммунохимия. Клетки должны иметь небольшой сома и ветвящихся процессов, (F) на низких confluency и (G) готовы к иммунохимии. Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Приток кальция, жить клеточной проточной цитометрии
Этот протокол позволяет для анализа функции рецептора P2X7 как кальциевых каналов в режиме реального времени. Кинетика функции рецепторов, а также последствия различных агонистов и антагонистов, также может быть оценена. Когда печать над время, приток кальция в гиппокампе и нейронных прогениторных клеток SVZ был в целом аналогичные (рисунок 2A и 2B рисунок, соответственно). Агонисты (АТФ или BzATP) были добавлены на метке 40 s, как указано красной стрелкой. На мгновение трубка удаляется из точки записи для добавления агонист, что приводит к точкам данных нулевой. Это позволит для определения времени, когда был добавлен агониста. BzATP быстро активирует P2X7 рецепторы, открытию ионного канала и позволяя приток кальция, который связывает Fluo-8 и флуоресцирует. СПС приложения обычно приводит к более постепенный приток кальция. Он имеет меньше сродством к P2X7 по сравнению с BzATP и также приведет к активации сочетании G-белка рецептора, медленнее сигнальный путь, который выпускает кальций из эндоплазматического ретикулума. Включение P2X7 антагонисты A438079 и AZ10606120 (данные не показаны) сократить приток кальция в ответ на применение агонистов.
Рисунок 2: приток кальция клеток в нейронных прогениторных клеток гиппокампа и SVZ. P2X7 рецептор кальция канала функция была продемонстрирована в (A) гиппокампа и клеток SVZ-производные прародитель (B) изменения в флуоресцировании Fluo-8. Применение общего P2X агонист АТФ и P2X7 агониста BzATP результат в P2X7 ионные каналы открытие, позволяя приток кальция. Приток был заблокирован с P2X7-специфические ингибиторы A438079 или AZ10606120 (данные не показаны). F = флуоресценции; F0 = флуоресценции в момент времени 0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Порообразования подачей cytometry клеток
Трансмембранный порообразования является функцией каноническое P2X7 рецепторов, результаты в макромолекулы обмен и может привести к смерти клетки. Ethidium+ является большая молекула (314 Da), исключены из здоровых клеток; его поглощения и последующего Интеркаляция ДНК приводит к Флуоресцентные выбросов и может использоваться для оценки способности P2X7 рецепторов сформировать трансмембранного поры. После применения агонистов АТФ (1 мм АТФ) и BzATP (100 мкм) на 40 s (указано стрелкой), время решена проточной цитометрии захватывает бромид ethidium, введя клетки в режиме реального времени (рис. 3A). Этот эффект был аттенуированных P2X7-специфические ингибиторы AZ10606120. Assay поглощение бромид ethidium демонстрирует функциональные P2X7 рецептор C-конечная17 и хорошо доказательства для полнометражных экспрессии рецепторов P2X7. ATP концентрация реакция анализов иллюстрируют эффекты агонистов концентрации на P2X7 порообразования, используя изменения в флуоресцировании бромид ethidium со временем (рис. 3B). Агонист дозе концентрации кривых вместе с рецепторов специфичные ингибиторы обеспечивают убедительные доказательства для активации рецептора.
Рисунок 3: P2X7 трансмембранного порообразования измеряется ethidium поглощения. Помимо моментов бромид ethidium до начала приобретения используется для измерения формирования P2X7 трансмембранного поры. Высокие концентрации АТФ и BzATP результат в (A) P2X7 рецептор поры формирования, позволяя бромид ethidium войти в камеру. P2X7 ингибитор AZ10606120 ослабляет это явление и предоставляет доказательства для функциональных P2X7 рецепторов. (B) СПС концентрация реакция анализов продемонстрировала значительные порообразования в 500 мкм и 1 мм, но не при более низких концентрациях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фагоцитоз, жить клеточной проточной цитометрии
Наша группа продемонстрировала ранее внеклеточного АТФ тормозит P2X7-опосредованной фагоцитоза путем отделения P2X7 C-конечная от цитоскелета, в частности, nonmuscle миозин IIA18,19. Этот метод расширяет на этих выводах продемонстрировать P2X7 рецептор участие в фагоцитозе гиппокампа и клеток SVZ нейронных прародитель в режиме реального времени (рис. 4, пример гиппокампа фагоцитоза). Раскованный фагоцитоза (управления) уровня 1 мкм YG латексные шарики были созданы как позитивный элемент управления. СПС тормозится фагоцитоза YG бусины в той же степени, как неспецифические ингибиторы, а именно PFA фиксации и cytochalasin ингибитор полимеризации актина D, в то время как 5% сыворотки отменили все врожденные фагоцитоза20.
Рисунок 4: YG шарик поглощения, демонстрируя фагоцитарной способности нейронных прародителями через рецепторы P2X7. YG шарик поглощение нейронных прогениторных клеток наблюдается с использованием клеток проточная цитометрия в режиме реального времени. Контролировать уровень фагоцитоза установлены изначально и если количество клеток позволяет, подтвердил в конце выполнения. Участие P2X7 рецепторов обозначается угнетение фагоцитоза в присутствии АТФ, как это диссоциирует C-отель terminus из цитоскелет мембраны, предотвращая P2X7-опосредованной цитоскелета перестановок. Применения СПС заблокирован фагоцитоза в той же степени, как использование ингибиторов неспецифической фагоцитоза, включая параформальдегида (PFA) и cytochalasin D (CytD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Этот документ представляет подробный протокол для анализа функции рецептора P2X7 в нейронных прародитель клеточных культур, производный от взрослых нейрогенный ниши. Потенциальные приложения для взрослых нейронных прародитель клетки варьируются от научных исследований до терапевтических целях, и таким образом метод культуры должны быть надежной и воспроизводимость. Существует ряд ключевых аспектов настоящего Протокола, которые могут повлиять на качество конечной культуры. После удаления из черепа, мозг не должно быть позволено сухой и вскрытие должно выполняться как можно быстрее. Особенно с гиппокампе осторожность для устранения любых кровеносных сосудов или пленочной ткани приведет к Улучшенный прогениторных клеток урожайности. Процесса диссоциации и Тритурация может сильно повлиять на количество сфер, полученных в культуре; Агитируя ткани во время инкубации с трипсина ЭДТА приведет к более однородный раствор. Использование стекла, огонь полированные пастбище пипетки над P1000, пластиковая Пипетка Совет настоятельно рекомендуется сократить гибель клеток и улучшить результате культуры. Избегайте overtriturating. Несмотря на эти меры предосторожности процедура может создать много мусора в P0 культуре, и чтобы избежать потери клетки-предшественники, промывки или кормления культуры следует избегать до тех пор, пока сформировали сферах.
Целый ряд различий между гиппокампа и SVZ культур будет очевидным в P0. Гиппокампа культур дают меньше сферах, и это обычно придерживаются. Используете наконечник пипетки для осторожно поднимите сфер для первоначального прохода. Адгезивная сферах не наблюдалось в последующих проходах. Различные марки колбы культуры ткани может привести к сфере, особенно гиппокампа сферах, присоединиться и расти как колоний в нижней части блюда. Это не был найден изменять любые течению результаты для этого протокола, но должны контролироваться, и там, где это возможно, следует сохранить соответствие.
Предыдущие методы, используемые для измерения P2X7 рецептор функции, такие как патч зажима для записи приток кальция, длительным и трудоемким и можно передавать информацию только на одну ячейку. Этот протокол предоставляет быстрый и воспроизводимый метод для анализа все три основные функции рецепторов P2X7, с помощью одной машины. Время решена клеток проточной цитометрии позволяет для анализа всего населения и предоставляет информацию о кинетике приток кальция, порообразования и/или фагоцитарную функцию исследователь. В дополнение к этому проточной цитометрии может легко использоваться в качестве метода оценки маркер выражения шаблоны и населения анализ, основанный на уровнях выражения белка или размер ячейки.
При проведении этих экспериментов, могут наблюдаться различия в приток максимальной кальция, ethidium поглощения или фагоцитоза ставки между повторами. Чтобы минимизировать это, размер области, условий культуры и кормления режима должны быть согласованы как здоровье клеток будет иметь значительное влияние на результаты, полученные. Время на льду также может оказывать влияние данных, таким образом обеспечить все готовится заранее, так что время на льду является минимальным. Гарантировать согласованность краситель индикатор кальция, время загрузки. Еще одним фактором, который может привести к большие несоответствия в записи максимальной кальция является разница между партиями СПС. Подготовка запасов АТФ имеет решающее значение, и следует избегать использования различных пакетов для те же эксперименты. Сравнение старых и новых пакетов, чтобы убедиться, что СПС согласуется также рекомендуется. Эффективность P2X7 антагонистов также может быть зависит от линии клетки и партии, поэтому может потребоваться оптимизация инкубации раз и концентрации.
Стоит отметить, что приток кальция/измеряем является одним из наиболее важных и сложных клеточных функций и может быть опосредовано многие рецепторы. АТФ индуцированной кальция приток, как классический измерения для P2X7 канала/поры функции, не может точно отражать истинную функцию P2X7 рецепторов, как АТФ может также активировать P2Y рецепторы выпустить внутриклеточного кальция. В этом случае Барий может быть лучше катиона для использования вместо кальция, как ее приток является однонаправленным16. Чтобы различать вклад от P2Y рецепторов в приток кальция, условия, где средний K+ вместо CaCl2 добавляется 1 мм ЭДТА или этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-tetraacetic кислота (EGTA) может использоваться в этом анализа.
Этот протокол также может быть легко адаптирована для удовлетворения других типов клеток и может быть полезным для изучения функциональность альтернативных ионного канала рецепторов или рецепторов, которые участвуют в фагоцитозе. Этот метод также может быть адаптирована к поток цитометрии машину без модуля времени. Например может выполняться фагоцитоза анализов, где YG бусины добавляют 7-8 минут до анализ обычной проточной цитометрии. Держите клетки при 37 ° C и непрерывно вихрем их. Это не будет предоставлять информацию в реальном времени, но по-прежнему различия в средней заключительном флуоресцирования проинформирует исследователь относительно функциональности P2X7 рецепторов.
Интерес к P2X7 рецепторы как препарат целевой21,22 или даже как доставки лекарств маршрута23,24 , быстро растет, и поэтому постоянно должны быть методы для изучения этого загадочного рецептора адаптированы и улучшены для облегчить эти исследования. Этот протокол определяет методологий, которые могут быть использованы для изучения функции P2X7 в клетках взрослых нейронных прародителю, и ожидается, что достижение более глубокого понимания P2X7 рецепторов в нишах, нейрогенные может привести к достижения в лечении инсульта и другие ишемические повреждения.
Авторы не имеют ничего сообщать.
Авторы хотели бы поблагодарить Мария Kasherman и Хуан Синь за их вклад в это исследование. Эта работа была поддержана грантов от Ребекка л Купер медицинский исследовательский фонд М.В., T.C.L. и м.л. и T.C.L. из национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) Австралии (571100 и 1048082) и (Благотворительный фонд компании «Бакстер» Сидней, Австралия). Б.г. была поддержана Австралийский исследовательский совет (ARC) будущее стипендий (FT120100581), грантов проекта NHMRC (1048082, 1061419 и 1120095) и викторианской правительство оперативной инфраструктуры поддержки Грант института Флори. М.л. была поддержана Чарльз D. Келман, M.D. докторской Award (2010) от международного фонда исследования сетчатки (США).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
Oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
Tetramethylammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены