АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол представляет собой метод выполнения реологической характеристики слизи, которая находится на жаберных граблях (ГР) толстолобица. Вязкоупругие характеристики GR-слизи, полученные путем измерения вязкости, модулей хранения и потерь, оцениваются для кажущейся предельности текучести, чтобы понять механизм подачи фильтра в ГР.

Аннотация

Толстолобик, Hypophthalmichthys molitrix,является инвазивной планктиворной фильтрующей фидерной рыбой, которая заразила естественные водные пути верхнего бассейна реки Миссисипи из-за ее высокоэффективного механизма подачи фильтра. Характерные органы, называемые жаберными граблями (ГР), обнаруженные во многих таких фильтрующих питателей, способствуют эффективной фильтрации частиц пищи, таких как фитопланктон, размером в несколько микрон.

Мотивация исследовать реологию слизи GR проистекает из нашего желания понять ее роль в оказании помощи процессу подачи фильтра у толстолобица. Богатая слизью жидкость в «густом и липком» состоянии может способствовать адгезии пищевых частиц. Проникновение и транспорт через мембрану GR облегчается действием внешних сил сдвига, которые вызывают изменяющиеся скорости деформации сдвига. Таким образом, реология слизи может дать жизненно важный ключ к огромному аутоконкурентоспособной природе толстолобица в бассейне фильтрующих кормящих рыб. Исходя из этого, было установлено, что слизь ГР может обеспечивать адгезивную функцию для частиц пищевых продуктов и действовать как транспортное средство для оказания помощи в процессе подачи фильтра.

Основной целью протокола является определение предела текучести слизи, относящегося к минимальному напряжению сдвига, необходимому для инициирования потока, при котором необратимая пластическая деформация впервые наблюдается на структурированном вязкоупругом материале. Соответственно, реологические свойства слизи GR, т. е. вязкость, хранение и модули потерь, были исследованы для ее неньютоновской, сдвиго-истончаемой природы с использованием ротационного реометра.

Протокол, представленный здесь, используется для анализа реологических свойств слизи, извлеченной из жаберных граблей толстолобиком, выловленного в Харт-Крик на реке Миссури. Протокол направлен на разработку эффективной стратегии реологического тестирования и характеристики материала слизи, предполагаемой как структурированный вязкоупругий материал.

Введение

Толстолобик, Hypophthalmichthys molitrix,является планктиворным фильтрующим кормушкой и инвазивным видом, который проник в несколько естественных водных путей в Соединенных Штатах. Этот вид был первоначально интродуцирован в верхний бассейн реки Миссисипи для контроля цветения водорослей1,2,3. Толстолобик является чрезвычайно эффективным кормушителем. Как правило, его потребляемые пищевые частицы варьируются от 4 до 20 мкм до более крупного зоопланктона, которые составляют около 80 мкм3,4,5. Этот вид перетравл с другими местными рыбами и потенциально может нанести огромный ущерб местным водным путям, ограничив доступные ресурсы1,2,6. Таким образом, фильтрующие кормовые рыбы, такие как толстолобик и большеголовый карп, представляют серьезную угрозу для Великих озер1,2,6,7,8.

Фильтрующие кормовые рыбы обладают специальными органами, называемыми жаберными граблями (ГР), с тонким слоем слизи, обитающей на их поверхности. Эти органы повышают эффективность фильтрации и агрегации мелких частиц из поступающей жидкости. Целью протокола, представленного в настоящем описании, является характеристика неньютоновского, сдвигового истончающего свойства материала и предела текучести слизи GR, полученной с внутренней поверхности жаберных граблей в толстолобике. Значение предела текучести GR-слизи, установленное с помощью ротационного реометра, представляет интерес в данном исследовании. Измеренное напряжение предела текучести, также называемое «кажущееся напряжением предела текучести», зависит от методов испытаний, таких как устойчивая скорость сдвига или динамическая колебательная деформация типа9,10. Сдвиг-истончение, «жидкость предел-текучесть», претерпевает переход от твердого к жидкому поведению при критическом прикладном напряжении9,11. Кажущееся предел текучести - это минимальное напряжение сдвига, необходимое для инициирования потока или при котором необратимая пластическая деформация впервые наблюдается, когда слизь переходит из гелеобразного материала в жидко-подобный материал. Такое поведение можно наблюдать в структурированных вязкоупругих материалах. Переход от гелеобразного к жидкостному поведению грязевой слизи влечет за собой две функции: адгезивную роль для сбора пищевых частиц и роль транспортного средства для оказания помощи в процессе доставки и фильтрации твердых частиц. Расширенная функция слизи включает в себя создание диффузионных барьеров в резистентности к болезням и дыхании, обеспечение контролируемого высвобождения питательных факторов, токсичных компонентов и экскреции, создание метаболических путей для кормления и гнездования, помощь в защите хищников и производство модификаций пограничного слоя, которые улучшают локомоцию и эффективность движения12,13,14.

В отличие от простых жидкостей, сложные жидкости, такие как слизь, обладают свойствами, которые варьируются в зависимости от условий потока и требуют дополнительных параметров измерения для определения их физического поведения в масштабе объема. Для мониторинга вязкости и предела текучести GR-слизи проводятся реологические измерения с использованием ротационного реометра. Ротационный реометр применяет устойчивое или колебательное напряжение сдвига или деформацию с помощью вращающегося диска, контактирующего с образцом жидкости, и измеряет его реакцию. Обоснование использования этого прибора и метода заключается в том, что реометр может обеспечить набор измерений для описания свойств материала GR-слизи толстолобица, которые не могут быть определены только вязкостью.

Слизь является вязкоупругим материалом, и ее механическая реакция на навязанную деформацию находится между реакцией чистого твердого тела (регулируется законом упругости Гука) и реакцией чистой жидкости (управляемой законом вязкости Ньютона)15,16. Сложная макромолекулярная сеть, содержащаяся в слизи, может растягиваться и переориентироваться в ответ на внешние силы или деформацию. Вращающийся реометр состоит из геометрии конуса и пластины Пельтье, как показано на рисунке 1 и рисунке 2 (см. Таблицу 1 для спецификаций приборов). Целью данного исследования была разработка протокола для определения реологических свойств ГР-слизи. Преимуществом ротационного реометра перед вискозиметром является его способность производить динамические измерения с использованием небольших объемов образцов. Объем образца слизи GR в этом исследовании составил примерно 1,4 мл. Вискозиметр, с другой стороны, ограничен постоянными скоростями сдвига и требует больших объемов образца.

Ожидается, что реологические свойства слизи будут сильно варьироваться в пределах анатомии толстолобика. Например, свойства слизи, находящейся на поверхностях GR, могут отличаться от свойств эпибранхиального органа. Для учета потенциальной изменчивости свойств слизи в разных регионах рыбы полученный образец ГР-слизи разбавляли, а растворы трех концентраций создавали и тестировали с помощью ротационного реометра. Данные и результаты, касающиеся реологии слизи, представленные после выполнения протокола, продемонстрировали эффективность метода измерения. Иллюстративные данные, представленные в этой статье, не предназначены для обобщения всей популяции толстолобиком. Протокол, представленный в настоящем документе, может быть расширен для исследования реологии слизи в больших наборах образцов для проверки других гипотез.

Целью данного исследования является демонстрация вариации реологических свойств реологии слизи ГР с тремя различными концентрациями слизи (400 мг/мл, 200 мг/мл и 100 мг/мл). Концентрация 400 мг/мл представляет собой образец сырой слизи, собранный из рыбных ГР. Деионизированная вода (ДИ) использовалась для разбавления образца сырой слизи до концентраций 200 мг/мл и 100 мг/мл. Разбавление образцов слизи позволило оценить степень истончения сдвига и кажущийся предел текучести в зависимости от концентрации и определить концентрацию, при которой gr-слизь переходит в неньютоновское поведение. Шейкер использовался для разбиения любых больших скоплений слизи в образцах, чтобы смягчить ошибки в реологических данных из-за неоднородности.

У большинства позвоночных, включая рыб, преобладающими слизеобразующими макромолекулами являются гликопротеины (муцины), которые имеют тенденцию набухать в воде путем запутывания или химического сшивания и создают гелеобразный материал12,13,17,18,19,20. Высокомолекулярные, гелеобразующие макромолекулы и высокое содержание воды отражают скользкость в слизи13. Высокая степень межмакломолекулярных взаимодействий приводит к образованию геля, тогда как более низкие уровни межмакломолекулярных взаимодействий или разрыва связей приводят к образованию высоковязких флюидов21.

Процессам фильтрации пищевых частиц в рыбах, кормящихся фильтром, способствуют свойства, связанные со слизью GR, такие как когезия и вязкость, которые определяют ее потенциал для адгезии и прилипание22. Прочность адгезии на основе слизи зависит от конкретных межмолекулярных, электростатических или гидрофобных взаимодействий23. Sanderson et al.24 провели исследование суспензионного кормления у черной рыбы, в котором они обнаружили доказательства адгезии на основе слизи. Они заявили, что за адгезией взвешенных пищевых частиц со слизистой поверхностью следует транспорт агрегированных сгустков частиц, связанных вместе со слизью направленным потоком воды, действующим на нее24. Слизь, подверженная сдвиговым деформациям, образующаяся в результате потока воды, облегчает доставку пищевых частиц в органы пищеварения. Эндоскопические методы использовались для наблюдения за отфильтрованными частицами24.

Литература о диапазоне скоростей сдвига и практических пределах при реологическом тестировании ГР-слизи скудна. Поэтому руководство было запрошено у реологических исследований желудочной, носовой, шейной и легочной слизи, слизи кожи лосося, слизи hagfish и смазки поверхности костного сустава, в которых были изучены реологические характеристики и неньютоновские признаки11,12,25, 26,27,28,29,30,31. Совсем недавно влияние слизи рыбьей кожи на локомоцию и двигательную эффективность было изучено с помощью вискометрии с постоянной скоростью сдвига. Исследования реологии слизи кожи (без какого-либо разбавления или гомогенизации), относящиеся к морскому лесяму, морскому окуню и скудной области, продемонстрировали неньютоновское поведение при типично низких скоростях сдвига14.  В другом связанном исследовании было обнаружено, что образцы сырой слизи кожи с дорсальной и вентральной сторон сенегальской подошвы демонстрируют неньютоновское поведение, что указывает на более высокую вязкость вентральной слизи при всех скоростях сдвига, рассматриваемыхкак 32. Другие реологические протоколы, относящиеся к развитию гидрогелевых каркасов и для высококонцентрированных суспензий с использованием вискозиметра с постоянной скоростью сдвига, также были зарегистрированы в литературе33,34.

В этом исследовании свойства слизи GR были исследованы с использованием ротационных реометров с контролируемой скоростью деформации, который широко использовался в реологических экспериментах на сложных биологических жидкостях25. Для ньютоновских жидкостей кажущаяся вязкость остается постоянной, не зависит от скорости сдвига, а напряжения сдвига изменяются линейно со скоростью деформации сдвига(рисунок 3A,B). Для неньютоновских жидкостей (таких как жидкости, разжижающих сдвиг) вязкость зависит от скорости сдвига или от истории деформации(рисунок 3A,B). Модуль потерь (G") представляет степень, в которой материал сопротивляется склонности к текучести и является репрезентативным для вязкости жидкости(рисунок 4). Модуль хранения (G') представляет собой тенденцию материала к восстановлению своей первоначальной формы после деформации, вызванной напряжением, и эквивалентен упругости(рисунок 4). Фазовый угол (δ) или значение касательной потерь вычисляется из обратного тангенса G"/G'. Он представляет собой баланс между потерей энергии и хранением, а также является общим параметром для характеристики вязкоупругих материалов (δ = 0° для твердого вещества Хуке; δ = 90° для вязкой жидкости; δ < 45° для вязкоупругого твердого вещества и δ > 45° для вязкоупругой жидкости)(рисунок 4)25. Кажущееся предел текучести (σy)в структурированных жидкостях представляет собой изменение состояния, которое можно наблюдать в реологических данных из устойчивого состояния развертки и динамических разверток напряжения-деформации10. Если внешнее приложенное напряжение меньше кажущейся предельной текучести, материал будет деформироваться упруго. Когда напряжение превышает кажущееся предел текучести (обозначенное как «среднее напряжение» на рисунке 3B),материал перейдет от упругой к пластической деформации и начнет течь в жидком состоянии35. Измерение модуля накопления (G') и модуля потерь (G") в образце слизи в условиях колебательного напряжения (или деформации) количественно определяет изменение состояния материала от гелеобразного до вязкоупругого жидкого поведения.

Здесь описаны типы тестов реометра, выполняемых для мониторинга данных, относящихся к модулю хранения (G'), модулю потерь (G") и кажущейся вязкости (η). Динамические испытания колебаний (развертки деформации и частотные развертки) контролировали G' и G" при контролируемых колебаниях геометрии конуса. Динамические испытания на развертку деформации определяли линейную вязкоупругую область (LVR) слизи путем мониторинга внутренней реакции материала(рисунок 4). Деформационные развертки использовались для определения поведения выхода при постоянной частоте колебаний и температуре. В ходе динамических испытаний на частотную развертку контролировалась характеристика материала на возрастающую частоту (скорость деформации) при постоянной амплитуде (деформация или напряжение) и температуре. Деформация поддерживалась в линейной вязкоупругой области (LVR) для динамических испытаний на частотную развертку. В ходе стационарных испытаний на скорость сдвига наблюдалась кажущаяся вязкость (η) при устойчивом вращении геометрии конуса. СЛИЗЬ ГР подвергали постепенным шагам напряжения, а кажущуюся вязкость (η, Па.с)) контролировали на предмет различной скорости сдвига (ý, 1/с).

Протокол, представленный в данной статье, рассматривает слизь GR как сложный структурированный материал неизвестной вязкоупругости с определенным линейным диапазоном вязкоупругого отклика. Рыбья слизь была извлечена из ГР толстолобика во время рыболовной экспедиции на месте ручья Харт в реке Миссури профессором Л. Патрисией Эрнандес (Департамент биологических наук, Университет Джорджа Вашингтона) 1,2,36.  Массив ГР внутри устья толстолобица показан на рисунке 5А, а схематический рисунок представлен на рисунке 5B. Исеченный ГР показан на рисунке 5C.  Извлечение слизи из ГР толстолобица представлено в качестве примера на схематических рисунках, рисунок 5D,E. Все испытания реометра проводились при постоянной, контролируемой температуре 22 ± 0,002 °C, температура, зарегистрированная на месте промысла1,2,36.  Каждый образец слизи был протестирован три раза с помощью реометра, и усредненные результаты представлены вместе со статистическими погрешностностями.

протокол

1. Приготовление растворов слизи различной концентрации

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента подготовлены три концентрации раствора слизи (400 мг/мл, 200 мг/мл и 100 мг/мл с приблизительными объемами, 1 мл, 1 мл и 2 мл соответственно).

  1. Чтобы рассчитать массу слизи, измерьте среднюю массу флаконов с (Mс-слизью; мг) и без слизи(Мфлаконы); мг). Затем вычтите массу флаконов со слизью из слизи без слизи (Mслизь = M сослизью - Mфлаконы ; мг).
  2. Разбавьте слизь в трех концентрациях (400, 200, 100 мг/мл) деионизированной (DI) водой.
    1. Приготовьте первую концентрацию раствора слизи, 400 мг/мл, добавив 0,6 мл воды DI в слизь с помощью микропипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку приблизительный объем экстрагированной слизи составлял 1,4 мл, раствор 400 мг/мл будет иметь общий объем ~ 2 мл.
    2. Поместите флакон с раствором слизи 400 мг / мл на шейкер, чтобы убедиться, что раствор слизи адекватно гомогенизирован, и любая агломерация частиц слизи смягчается.
    3. Подготовьте вторую концентрацию раствора слизи, 200 мг/мл, втянув половину объема раствора слизи первой концентрации в новый флакон с помощью микропипетки и добавив 1 мл воды DI в новый флакон.
    4. Повторите шаг 1.2.2 для первого и второго флаконов со слизью.
    5. Подготовьте третью концентрацию раствора слизи, 100 мг/мл, втянув половину объема (1 мл) раствора 200 мг/мл в новый флакон с помощью микропипетки и добавьте воду DI в новый флакон.
    6. Повторите этап 1.2.2 для всех трех концентраций растворов слизи в соответствующих флаконах (см. дополнительный рисунок 1).
    7. Храните флаконы со слизью в холодильнике до тех пор, пока не будет выполнена калибровка и тестирование реометра.

2. Измерения и сбор данных с помощью реометра

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, используемое в этом протоколе для управления прибором и сбора данных с помощью реометра, указано в таблице материалов. Это программное обеспечение будет называться «программным обеспечением для управления приборами реометра».

  1. Настройте и откалибруйте прибор реометра.
    1. Включите подачу сжатого воздуха к реометру и убедитесь, что пневматический стол и реометр выровнированы с помощью пузырькового датчика. Сверните защитный колпачок на валу реометра и удерживайте вал неподвижно, пока он откручивается.
    2. Включите основные переключатели реометра, чтобы активировать магнитные подшипники на реометре.
    3. Включите компьютер управления реометром с установленным в нем программным обеспечением для управления реометром и запустите программное обеспечение для управления прибором реометра (см. Дополнительный рисунок 2).
    4. Выполните калибровку прибора, выбрав вкладки 'Калибровка | Инструмент' из окна программного обеспечения. Выберите опцию'Инструмент'. Нажмите«Калибровка»в разделе«Инерция». Запишите калибровочное значение инерции прибора в мкН.m.с2 и повторите калибровку не менее 3x, чтобы убедиться, что калибровочные значения находятся в пределах 10% друг от друга (см. Дополнительный рисунок 3).
  2. Установите геометрию реометра на вал реометра.
    1. Перейдите на вкладку«Геометрия»в программном обеспечении управления реометром.
    2. Очистите конус с нужной геометрией (диаметр 40 мм, 1◦ 0' 11'' конус) и пластину Пельтье изопропанолом (см. Таблицу 1, Таблицу материалов, Рисунок 1,и Рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина Пельтье устанавливается на реометр; его можно очистить изопропанолом, при этом он непосредственно закреплен на реометре.
    3. Убедитесь, что пластинчатый светильник Пельтье свободен от видимой пыли и, при необходимости, очищен изопропанолом. Установите пластину Пельтье, если она не установлена предварительно в реометре, и подключите соединения радиатора.
    4. Нажмитекнопку 'Lock'на реометре к валу замка, который подключен к геометрии конуса. Это замыкает положение вала, но он может свободно вращаться в положении.
    5. Нажмите на 'Smart Swap | Включено' на вкладке программного обеспечения для управления прибором реометра, чтобы обеспечить автоматическое определение геометрии (см. Дополнительный рисунок 4).
    6. Поверните вал поверх реометра, чтобы прикрутить геометрию. На этом этапе программное обеспечение определит геометрию угла конуса диаметром40 мм, 1 ◦ 0' 11 '' (см. Таблицу 1 и Таблицу материалов).
    7. Повторите шаги 2.2.5 – 2.2.6, чтобы убедиться, что геометрия определена.
    8. Выберите'Gap'под'Панель управления'программного обеспечения управления реометром, нажмите на значок'Options'и выберите'Axial Force'. Установите осевую силу в'1 Ньютон'; это необходимо для того, чтобы геометрия конуса касался пластины Пельтье для инициализации с нулевым зазором (см. Дополнительный рисунок 5).
  3. Выполните калибровку геометрии реометра.
    1. Выберите вкладку'Геометрия'в окне программного обеспечения. Нажмите«Калибровка»в разделе«Инерция». Запишите калибровочное значение инерции геометрии в мкН.m.с2 и повторите это 2-3 раза, чтобы убедиться, что калибровочные значения находятся в пределах 10% друг от друга.
    2. Нажмите«Калибровка»в разделе«Трение»в окне программного обеспечения. Запишите калибровочное значение трения геометрии в мкН.m/(рад/с) и повторите это 2-3 раза, чтобы убедиться, что калибровочные значения находятся в пределах 10% друг от друга (см. Дополнительный рисунок 6).
  4. Выполнение инициализации с нулевым зазором
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку геометрия не может быть точно поднята над пластиной Пельтье для выполнения измерений без опорного «нулевого» положения, выполняется инициализация с нулевым зазором. Для целей измерения геометрия имеет встроенный геометрический зазор 24 мкм и зазор обрезки 28 мкм. Зазор отделки настроен на эффективную очистку лишней жидкости, которая может выплеснуться за пределы поверхности геометрии. Эти пробелы необходимы для точного измерения данных с использованием образца и реометра. Шаг 2.4.1 абсолютно необходим для обеспечения того, чтобы геометрия была установлена на нулевой зазор для достижения геометрии и зазоров обрезки 24 мкм и 28 мкм соответственно.
    1. Нажмите на значок'Нулевой зазор'на вкладке'Gap'в'Панели управления'в окне программного обеспечения. Инициализация завершается, когда осевая сила, испытываемая геометрией, больше или равна 1 Н, поскольку она касается пластины Пельтье. Убедитесь, что зазор реометра обнулен таким образом, чтобы его опорное положение было точным (см. Дополнительный рисунок 7 и Дополнительный рисунок 8).
    2. Нажмите 'стрелки вверх и вниз' элементы управления на реометре или значки 'геометрия поднимать и опускать' под вкладкой 'Gap' в программном обеспечении управления реометром прибора, чтобы поднять геометрию на любую произвольную высоту. Экран управления на приборе реометра и панель управления программного обеспечения управления реометром будут отображать (одинаковую) высоту зазора.
  5. Настройте экспериментальную процедуру в программном обеспечении управления реометром. Выполните характеристику реологических свойств с помощью геометрии пластины конуса на Пельтье при 22 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Веб-сайт Геологической службы США был использован для определения температуры воды в реке 20 сентября 2018 года, когда толстолобик, используемый для экспериментов со слизью GR, был выловлен в месте36Харт-Крик. Температура слизи может влиять на реологические свойства. Значение корректировки значений температуры реки заключается в том, чтобы приблизительно соответствовать температуре, при которой свойства слизи могут быть реально оценены.
    1. Выберите вкладку«Эксперименты»в программном обеспечении для управления реометром и заполните соответствующую информацию, такую как«Имя»,«Оператор»,«Проект»и т. Д.  (см. дополнительный рисунок 9)
    2. Выберите вкладку'Геометрия'и убедитесь, что информация согласуется с шагами 2.2.5. - 2.2.7. (см. дополнительный рисунок 10).
    3. Выберите вкладку'Процедура'и с помощью клавиш со стрелками настройте процедуру '1: Амплитуда колебаний'. (см. дополнительный рисунок 11).
    4. Инициализируйте настройки'Environmental Control'следующим образом: 'Температура = 22 °C'; 'Время замачить = 120 с' и погверните флажок 'Дождаться температуры' (см. Дополнительный рисунок 11).
    5. Инициализируйтенастройки 'Тестовые параметры'следующим образом: 'Частота = 1 Гц'; набор 'Логарифмическая развертка'; 'Крутящий момент = от 10 до 10000 мкН.m'; «Баллов за десятилетие = 5» (см. дополнительный рисунок 11).
  6. Установить эксперимент для определения линейного вязкоупругого диапазона (LVR) слизи известной концентрации (100 мг/мл)
    1. С помощью соответствующей микропипетки и наконечника пипетки вытягивайте приблизительно 0,3 мл раствора рыбьей слизи концентрацией 100 мг/мл (см. Этап 1.2, Таблица материалов).
    2. Введите раствор слизи на пластину Пельтье с помощью микропипетки (см. рисунок 2).
    3. Нажмите кнопку'Trim Gap'на реометре, чтобы понизить геометрию на пластине Пельтье. Кроме того, нажмите на значок'Trim Gap'на вкладке'Gap'в опции'Панель управления'в программном обеспечении для управления реометром (см. Дополнительный рисунок 12).
    4. Используйте микропипетку с наконечником пипетки, чтобы удалить любой избыточный раствор слизи и убедиться, что жидкость находится под геометрией без какого-либо разлива вблизи периферии геометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильная загрузка жидкости приведет к ошибкам в измерениях. Под заполненным образцом будет ниже распределение крутящего момента, а перенаполненный образец приведет к ошибочному распределению напряжений из-за разлива по краям.
    5. Выберите вкладки'Двигатель'и'Скорость'до 5 рад/с и 0 рад/с попеременно, пока в образце под геометрией не будет минимальной инерции и скорости. Экран управления на приборе реометра и панель управления программного обеспечения управления реометром будут отображать скорость (см. Дополнительный рисунок 13).
    6. Нажмите кнопку'Geometry Gap'на реометре, чтобы понизить геометрию до заданного подходящего зазора для конкретной геометрии. Кроме того, нажмите на значок'Geometry Gap'на вкладке'Gap'в опции'Панель управления'в программном обеспечении для управления реометром (см. Дополнительный рисунок 14).
  7. Провести эксперимент по определению линейного вязкоупругого диапазона (LVR) слизи известной концентрации (100 мг/мл).
    1. Нажмите значок'Пуск'на программном обеспечении управления прибором реометра (см. Дополнительный рисунок 15).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реометр выполняет автоматические измерения; как только кнопка'Start'будет нажата, реометру потребуется около 20 минут для завершения теста. Параметр «Точек за десятилетие» на шаге 2.5.5 определяет, сколько времени потребуется реометру для завершения измерений.
    2. Запустите эксперимент, щелкнув«Да»во всплывающем окне, которое появляется и предлагает снизить геометрический зазор до правильного расстояния, чтобы начать эксперимент, если он еще не опущен.
    3. Наблюдайте за графиком в реальном времени, генерируемым реометром, который сообщает модули хранения (G') и потерь (G'').
      ПРИМЕЧАНИЕ: G' и G" являются модулями хранения и потерь соответственно. Модуль хранения представляет собой тенденцию к восстановлению материалом своей первоначальной формы после деформации, вызванной напряжением, и эквивалентен упругости. Модуль потерь представляет собой степень, в которой материал сопротивляется склонности к текучести и является репрезентативным для вязкости жидкости (см. Рис. 4).
    4. Установите для оси X графика значение'Процент деформацииколебаний'. Для этого щелкните правой кнопкой мыши на представленном графике и выберитевкладку 'Graph Variables' (см. Дополнительный рисунок 16).
    5. Запишите процентный диапазон деформаций колебаний с графика, прежде чем материал войдет в нелинейный вязкоупругий диапазон после завершения испытания.
    6. Нажмите'стрелки вверх и вниз'на реометре илизначки 'геометрия поднимает и опускает'под вкладкой'Gap'в программном обеспечении управления реометром, чтобы поднять геометрию на любую произвольную высоту над пластиной Пельтье.
    7. Сохраните файл, содержащий как экспериментальную процедуру, так и результаты в собственном формате файла программного обеспечения для управления реометром, чтобы определить линейную вязкоупругость (LVR) образца слизи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать, установив ось X графика на амплитуду деформации (%) и/или напряжение колебаний figure-protocol-14165 до того, как данные попадут в нелинейную вязкоупругую область (NLVR) (см. Дополнительный рисунок 16).
  8. Провести эксперименты по динамическому развертке и устойчивому сдвигу потока в линейном вязкоупругом диапазоне (LVR) для слизи известной концентрации 100 мг / мл для получения результатов из трех независимых образцов слизи 100 мг / мл. Выполните эти шаги на доступных образцах концентрации слизи по отдельности.
    1. Повторите шаги 2.5.1 – 2.5.4.
    2. Инициализируйтенастройки 'Тестовые параметры'следующим образом: 'Частота = 1 Гц'; набор 'Логарифмическая развертка'; 'Деформация % = от 100 до 10000 %; 'Очков за десятилетие = 10'.
    3. Выберите вкладку'Процедура'и с помощью клавиш со стрелками настройте процедуру '2: Частота колебаний'.
    4. Инициализируйте настройки'Environmental Control'следующим образом: 'Температура = 22 °C'; 'Время замачить = 0.0 с'.
    5. Инициализируйтенастройки 'Тестовые параметры'следующим образом: 'Деформация % = 1 %'; набор 'Логарифмическая развертка'; 'Частота = от 20 до 1 Гц'; 'Очков за десятилетие = 10'.
    6. Выберите вкладку'Процедура'и с помощью клавиш со стрелками настройте процедуру '3: Flow Sweep'.
    7. Инициализируйте настройки'Environmental Control'следующим образом: 'Температура = 22 °C'; 'Время замачить = 0.0 с'.
    8. Инициализируйтенастройки 'Тестовые параметры'следующим образом: 'Скорость сдвига = от 1 до 10000 1/с'; 'Баллов за десятилетие = 10'; флажок 'Датчик устойчивого состояния'.
    9. Повторите шаги 2.7.1 – 2.7.2 и дождитесь завершения эксперимента, примерно 45 минут.
    10. Нажмите'стрелка вверх и вниз'на реометре или значки 'геометрия поднимается и опускается' на вкладке 'Gap' в программном обеспечении управления реометром, чтобы поднять геометрию на любую произвольную высоту.
    11. Используйте одноразовые салфетки и перчатки для удаления и очистки слизи на пластине Пельтье раствором изопропанола (см. Таблицу материалов).
    12. Сохраните файл, содержащий как экспериментальную процедуру, так и результаты в собственном формате файла программного обеспечения управления реометром.

3. Повторите протокол для других концентраций растворов слизи 200 мг/мл и 400 мг/мл.

  1. Выполните шаги 2,5 – 2,8, включая все перечисленные в них подэтаймы для оставшихся двух концентраций растворов слизи, 200 мг/мл и 400 мг/мл.

4. Графическое представление и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Код, представленный в файле дополнительного кода, выполняет усреднение данных и генерирует ошибки повторяемости, накладывает данные из всех экспериментов. Функции расчета стандартного отклонения недоступны в программном обеспечении управления реометром. Код написан на языке программирования для анализа данных, постобработки и графического представления (подробнее см. Таблицу материалов).

  1. Экспорт данных, полученных на этапе 2.8, относящемся к концентрации слизи ГР 100 мг/мл, и на этапе 3.1, относящемся к концентрациям слизи ГР 200 мг/мл и 400 мг/мл ГР, в формат электронной таблицы, щелкнув вкладку 'Файл | Экспорт | Excel' в программном обеспечении управления реометром (см. Дополнительный рисунок 17).
  2. Запустите дополнительные коды для создания графиков кажущейся вязкости (η) для различных скоростей деформации сдвига ( figure-protocol-17877 ) и модуля потерь (G"), модуля хранения (G') и фазового угла (δ) для изменяющегося напряжения колебаний ( figure-protocol-18049 ) и получения репрезентативных результатов.

Результаты

В этом разделе мы представляем результаты экспериментов на GR-слизи с использованием ротационного реометра с геометрией конуса (диаметр 40 мм, 1° 0' 11'') и пластины Пельтье. Эксперименты помогли охарактеризовать неньютоновское, истонченное поведение грязевой слизи GR и кажущийся предел тек...

Обсуждение

Одной из основных целей разработки этого протокола является установление того, что он хорошо подходит для реологической характеристики слизи ГР при наличии очень малых объемов образцов. Мы признаем, что для полной характеристики реологических свойств слизи GR необходимы дополнительн?...

Раскрытие информации

Конфликт интересов не заявлен.

Благодарности

Авторы признают поддержку и финансирование со стороны Центра биомиметики и биоинспирированной инженерии GW. Мы благодарим профессора Л. Патрисию Эрнандес из Департамента биологических наук Университета Джорджа Вашингтона за вдохновение для исследования и постоянного сотрудничества, предоставление биологической экспертизы по физиологии толстолобиком и предоставление образцов слизи. Мы благодарим студентов, г-на Дэвида Палумбо, г-жу Карли Коэн, г-на Исаака Финберга, г-на Доминика Петросино, г-на Алексиса Рендероса, г-жу Присциллу Варгезе, г-на Картера Тегена и г-на Рагхава Паджжура за помощь в лаборатории и г-на Томаса Эванса и г-на Джеймса Томаса из TA Instruments, New Castle, DE за поддержку в обучении и обслуживании реометра. Изображения для рисунков 5A, C были сделаны во время вскрытия, выполненного профессором Л. Патрисией Эрнандес с факультета биологических наук в Университете Джорджа Вашингтона.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Kim WipesVWR470224-038To clean Sample from plate
GlovesVWR89428-750To prevent contamination of sample
PipetteVWR89079-974To transport sample from vial to rheometer
Pipette TipsThermo Scientific72830-042To transport sample from vial to rheometer
ShakerVWR89032-094To homogenously mix sample of mucus
VialsVWR66008-710Contains measured sample volumes
Weigh ScaleOhausScout –SPX BalancesTo weigh mass of mucus samples
Chemical Reagents
De-Ionized Water (H20)--Liquid
Sterile 70% Isopropanol (C3H8O)VWR89108-162Liquid
GR Mucus
100 mg/mL concentration, 2mL--Viscoelastic Material
400 mg/mL concentration, 1mL--Viscoelastic Material
200 mg/mL concentration, 1mL--Viscoelastic Material
Software
MATLABMathworksR2017aData analysis, post-processing and graphical representation
TriosTA Instrumentsv4.5.042498Rheometer instrument control and analysis software

Ссылки

  1. Cohen, K. E., Hernandez, L. P. The complex trophic anatomy of silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, highlighting a novel type of epibranchial organ. Journal of Morphology. 279, 1615-1628 (2018).
  2. Cohen, K. E., Hernandez, L. P. Making a master filterer: Ontogeny of specialized filtering plates in silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of Morphology. 279, 925-935 (2018).
  3. Cremer, M., Smitherman, R. Food habits and growth of silver and bighead carp in cages and ponds. Aquaculture. 20 (1), 57-64 (1980).
  4. Battonyai, I., et al. Relationship between gill raker morphology and feeding habits of hybrid bigheaded carps (Hypophthalmichthys spp.). Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 416, 36 (2015).
  5. Zhou, Q., Xie, P., Xu, J., Ke, Z., Guo, L. Growth and food availability of silver and bighead carps: Evidence from stable isotope and gut content analysis. Aquaculture Research. 40 (14), 1616-1625 (2009).
  6. Freedman, J. A., Butler, S. E., Wahl, D. H. . Impacts of invasive Asian carps on native food webs (Final Report). , (2012).
  7. Nico, L., Fuller, P., Li, J. . Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)-FactSheet. , (2017).
  8. Walleser, L., Howard, D., Sandheinrich, M., Gaikowski, M., Amberg, J. Confocal microscopy as a useful approach to describe gill rakers of Asian species of carp and native filter-feeding fishes of the upper Mississippi River system. Journal of Fish Biology. 85 (5), 1777-1784 (2014).
  9. Nelson, A. Z., Ewoldt, R. H. Design of yield-stress fluids: a rheology-to-structure inverse problem. Soft Matter. 13, 7578-7594 (2017).
  10. Chen, T. Rheological Techniques for Yield Stress Analysis. TA Instruments Applications Note, RH025. , (2020).
  11. Ewoldt, R. H., Johnston, M. T., Caretta, L. M., Spagnolie, S. Experimental challenges of shear rheology: how to avoid bad data. Complex Fluids in Biological Systems. , (2015).
  12. Thornton, D. J., Sheehan, J. K. From Mucins to Mucus: Toward a more coherent understanding of this essential barrier. Proceedings of the American Thoracic Society. 1, 54-61 (2004).
  13. Shepard, K. L. Functions for fish mucus. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4, 401-429 (1994).
  14. Fernández-Alacid, L., et al. Skin mucus metabolites in response to physiological challenges: A valuable non-invasive method to study teleost marine species. Science of the Total Environment. 644, 1323-1335 (2018).
  15. Wagner, C. E., Wheeler, K. M., Ribbeck, K. Mucins and Their Role in Shaping the Functions of Mucus Barriers. Annual Reviews in Cell and Developmental Biology. 34, 189-215 (2018).
  16. Bird, R. B., Armstrong, R. C., Hassager, O. . Dynamics of Polymeric Liquids, Volume 1: Fluid Mechanics. , 1255-1284 (1987).
  17. Mantle, M., Allen, A. Isolation and characterisation of the native glycoprotein from pig small intestinal mucus. Biochemical Journal. 195, 267-275 (1981).
  18. Allen, A., Hutton, D. A., Pearson, J. P., Sellers, L. A., Nugent, J., O'Conner, M. Mucus glycoprotein structure, gel formation and gastrointestinal mucus function. Mucus and Mucosa (Ciba Foundation Symposium). , 137-156 (1984).
  19. Asakawa, M. Histochemical studies of the mucus on the epidermis of eel, Anguillajaponica. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 36, 83-87 (1970).
  20. Fletcher, T. C., Jones, R., Reid, L. Identification of glycoproteins in goblet cells of epidermis and gill of plaice (Pleuroneces platessa L.), flounder (Platichthys flesus (L.)) and rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Histochemical Journal. 8, 597-608 (1976).
  21. Silberberg, A. Mucus glycoprotein, its biophysical and gel forming properties. Symposia of the Society for Experimental Biology. 43, 43-64 (1989).
  22. Hills, B. . The Biology of Surfactants. , 408 (1988).
  23. Aubert, H., Brook, A. J., Shephard, K. L. Measurement of the adhesion of a desmid to a substrate. British Phycology Journal. 24, 293-295 (1989).
  24. Sanderson, S. L., Cech, J. J., Patterson, M. R. Fluid dynamics in suspension feeding black fish. Science. 251, 1346-1348 (1991).
  25. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (2), 86-100 (2009).
  26. Chaudhary, G., Ewoldt, R. H., Thiffeault, J. L. Unravelling hagfish slime. Journal of Royal Society Interface. 16 (150), 20180710 (2019).
  27. Downing, S., Salo, W., Spitzer, R., Koch, E. The hagfish slime gland: a model system for studying the biology of mucus. Science. 214, 1143-1145 (1981).
  28. Hwang, S. H., Litt, M., Forsman, W. C. Rheological properties of mucus. Rheologica Acta. 8, 438-448 (1969).
  29. Litt, M. Mucus rheology. Archives of Internal Medicine. 126, 417-423 (1970).
  30. Quarishi, M. S., Jones, N. S., Mason, J. The rheology of nasal mucus: a review. Clinical Otolaryngology. 23, 403-413 (1998).
  31. Nordgård, C. T., Draget, K. I., Seternes, T. Rheology of salmon skin mucus. Annual Transactions - The Nordic Rheology Society. 23, 175-179 (2015).
  32. Fernández-Alacid, L., et al. Comparison between properties of dorsal and ventral skin mucus in Senegalese sole: Response to an acute stress. Aquaculture. 513, 734410 (2019).
  33. Yüce, C., Willenbacher, N. Challenges in Rheological Characterization of Highly Concentrated Suspensions - Case Study for Screen-printing Silver Pastes. Journal of Visualized Experiments. (122), e55377 (2017).
  34. Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), (2019).
  35. Barnes, H. A., Hutton, J. F., Walters, K. . An Introduction to Rheology. , (1989).
  36. USGS Current Conditions for USGS 06910450 Missouri River at Jefferson City, MO. U.S. Geological Survey Available from: https://nwis.waterdata.usgs.gov/usa/nwis/uv/?cb_00010=on&cb_00060=on&cb_00065=on&format=gif_default&site_no=0691045&p09-19&end_date=2018-09-21 (2020)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

161

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены