Модель частичной гетеротопной трансплантации задних налимов у крыс

Резюме

В этой статье представлен протокол частичной гетеротопной трансплантации остеомиокожного лоскута у крыс и ее потенциальные результаты в среднесрочном последующем наблюдение.

Аннотация

Васкуляризированные композитные аллотрансплантации (VCA) представляют собой наиболее продвинутый вариант реконструкции для пациентов без аутологичные хирургические возможности после сложного дефекта тканей. Трансплантация лица и рук изменила жизнь изуродованных пациентов, придав им новый эстетический и функциональный социальный орган. Несмотря на многообещающие результаты, VCA по-прежнему отстает из-за пожизненных сопутствующих заболеваний иммуносупрессии и инфекционных осложнений. Крыса является идеальной животной моделью для исследований in vivo, изучающих иммунологические пути и механизмы отторжения трансплантата. Крысы также широко используются в новых методах сохранения композитных тканевых трансплантатов, включая исследования перфузии и криоконсервации. Модели, используемые для VCA у крыс, должны быть воспроизводимыми, надежными и эффективными с низкой послеоперационной заболеваемостью и смертностью. Гетеротопные процедуры трансплантации конечностей соответствуют этим критериям и их легче выполнить, чем ортотопическую трансплантацию конечностей. Освоение микрохирургических моделей грызунов требует солидного опыта в микрохирургии и уходе за животными. В настоящем документе представлена достоверная и воспроизводимая модель частичной гетеротопной трансплантации остеокожной лоскутной лоскута у крыс, послеоперационные исходы и средства профилактики потенциальных осложнений.

Введение

За последние два десятилетия VCA развивался как революционное лечение для пациентов, которые страдают от тяжелого обезображивание, включая лицо^1,ампутации верхних конечностей^2,полового клетки³и другие сложные дефекты тканей^4,5. Однако последствия пожизненной иммуносупрессии по-прежнему препятствуют более широкому применению этих сложных реконструктивных операций. Фундаментальные исследования имеют решающее значение для улучшения стратегий борьбы с отторжением. Увеличение времени сохранения VCA также имеет важное значение для улучшения логистики трансплантации и увеличения донорского пула (поскольку доноры VCA должны соответствовать большему объему критериев, чем доноры твердых органов, включая тон кожи, анатомический размер, пол). В этом контексте трансплантация конечностей крыс широко используется в исследованиях иммунного отторжения аллотрансплантатов^6,7,новых протоколов индукции толерантности⁸и исследований сохранения^9,10,11. Следовательно, эти модели VCA являются ключевым элементом для освоения трансляционных исследований VCA.

Остеокожные лоскуты были описаны в литературе как надежные модели для изучения VCA у крыс^8,12,13,14. Хотя ортотопическая трансплантация целых конечностей позволяет проводить долгосрочную оценку функции трансплантата, это трудоемкая процедура, связанная с более высокими показателями послеоперационной заболеваемости и смертности^14. Напротив, гетеротопные модели трансплантации конечностей нефункциональны, но позволяют воспроизводить исследования VCA. Послеоперационные исходы можно достоверно предвидеть до начала исследования по трансплантации VCA на крысах. В этом исследовании сообщается о частичной гетеротопной модели трансплантации остеомиокожного лоскута у крысы, которая включает частые возможные исходы и осложнения, которые могут возникнуть внутриоперационно и послеоперационно в течение периода наблюдения в три недели.

протокол

Все животные получали гуманую помощь в соответствии с Руководством NIH по уходу за лабораторными животными и их использованию. Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию (IACUC-protocol 2017N000184) и Управление по уходу за животными и их использованию (ACURO) одобрили все протоколы для животных. Инбредные самцы крыс Льюиса (250-400 г) использовались для всех экспериментов.

1. Хирургия

1. Обезболивайте крыс Льюиса с помощью ингаляции изофлурана. Индуцировать анестезию 5% изофлураном в индукционной камере и поддерживать анестезию с 1,5-3% вдыханием изофлурана через дыхательный конус.
2. Применяйте глазную смазку перед операцией в процедурах выживания. Побрить место операции, обработать кремом для депиляции, скрабом и драпировать стерильными шторами.
3. Подтвердите полную анестезию с помощью теста на щипки носа перед разрезом и регулярно во время процедуры. Контролируйте частоту сердечных и дыхательных путей на протяжении всей процедуры. Для всех операций поддерживайте стерильные условия с помощью стерильных инструментов, расходных материалов, штор и перчаток. Список инструментов, используемых для процедур, приведен в Таблице материалов.

2. Частичное приобретение заднего задней частичного права

1. Сделайте окружной разрез кожи над лодыжкой в дистальной трети ноги.
2. Скелетонизируют и прижигают подкожную артерию и терминальную ветвь подколенной артерии с помощью биполярных щипцов. Прижигайте и отрезайте икроножные мышцы, камбалу, переднюю и двуберцовую мышцы бедра до тех пор, пока большеберцовая кость не будет открыта.
3. Сделайте разрез 2,5 см в правой паховой складке. Рассеките паховую жировую подушку и втяните ее дистально, чтобы обнажить бедренные сосуды. Используйте втягивающее машину для захвата паховой связки и зажимные щипцы, чтобы держать паховую жировую подушку дистально.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Паховая жировая подушка включается в сбор частичной конечности.
4. Рассечение бедренных сосудов, индивидуализация ветвей Мерфи (глубокие мышечные коллатеральные ветви обычно расположены на полпути между паховой связкой и эпигастральной ветвью) и лигата с 8-0 нейлоновые галстуки.
5. Гепаринизировать крысу-донора 100 МЕ/кг гепарина, вводимого в дорсальную вену полового железа с помощью иглы 27,5 г.
6. Завершите разрез кожи вокруг бедра.
7. Прижигают бицепс бедра и ягодичную мышцу с помощью биполярных щипцов. Прижижьте и перережьте седалищный нерв на средней длине бедренной кости. Обнажают бедренную комть проксимально на уровне заднего бедренного гребня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы аддуктора и квадрицепса исключены из закупки. Безымяная педикула сохранилась.
8. Лигат бедренных сосудов с 8/0 нейлоновыми завязками на уровне паховой связки. Выполните артериотомию бедренной артерии чуть ниже лигатуры и расширьте, чтобы обеспечить введение ангиокатетера 24 G.
9. Прижигите и разрежьте оставшуюся мышцу под педикулой, обнажив переднюю сторону бедренной кости.
10. Разрезайте большеберцовую и бедренную кости с помощью костяного резца как можно более проксимально и дистально соответственно (средней длины).
11. Промыть частичную заднюю конечность 2 мл гепаринового физиологического раствора (100 МЕ/мл) для получения прозрачного венозного оттока. Хранить на льду в стерильной марле до микрососудистогопереноса (рисунок 1).
12. Пока животное находится под общим наркозом, выполняйте эвтаназию путем экссангинации до тех пор, пока животное не покажет никаких признаков жизни (никаких дыхательных движений и сердцебиения).

Рисунок 1:Крысы частично заготавливают задние налимы. Ангиокарт 24 Г вводится в бедренную артерию, готовую к гетеротопному микрососудистой передаче. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Хирургия реципиента

1. Перед разрезом побрейте заднюю часть шеи и вводят бупренорфин 0,01-0,05 мг/кг подкожно. Поместите крысу в лежачем положении на грелке.
2. Сделайте разрез 2,5 см в правой паховой складке. Рассеките паховую жировую подушку и откидывайте ее дистально, чтобы обнажить бедренные сосуды. Используйте крючок, чтобы втянуть паховую связку и зажимные щипцы, чтобы держать паховую жировую подушку дистально.
3. Рассекте бедренные сосуды, индивидуализируйте ветви Мерфи и обжайте с помощью 8/0 нейлоновых завязок.
4. Раздвигайте оба сосуда над эпигастральными сосудами с помощью 8/0 нейлоновых связей. Расположите аппроксиматорные зажимы проксимально и расширите концы сосудов; промыть гепарином физиологическим раствором.
5. Сделайте разрез на левом боку над бедром, и создайте подкожный карман с подкожным туннелем к паховой складке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез вставки делается выше диапазона движения бедра, чтобы гарантировать, что животное поддерживает нормальное движение задней конечности. Кроме того, поддержание кожного моста между вставкой трансплантата и местом микрососудистого переноса позволяет лучше фиксировать трансплантат(рисунок 2).
6. Поместите проксимальную часть частичной конечности и паховую жировую подушку через подкожный туннель для микрососудистого переноса. Выполняйте венозные и артериальные анастомозы с использованием 10/0 нейлоновых швов. Снимите оба аппроксиматорных зажима и наблюдайте за реваскуляризацией конечности. Выполните «тест на доение» на обоих сосудах, чтобы оценить проходимость каждого анастомоза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Восемь-девять швов обычно необходимы для венозного анастомоза, 6 швов в среднем для артериального анастомоза.
7. Сделайте продольный разрез кожи на медиальную сторону пересаженная конечность и вставьте трансплантат. Удалите лишнюю кожу трансплантата и закройте рану отдельными швами и бегущим швом с помощью рассасывающихся швов 4/0.
8. Сшивайте паховые жировые подушечки пересаженного конечности и реципиента с помощью двух отдельных рассасывающихся швов, а паховую складку закрывают на самом конце после последнего осмотра микрососудистых анастомозов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Паховые жировые подушечки плотно зашиваются, чтобы добавить защитный слой жира над анастомозами и обеспечить надежное положение трансплантата и его цветоножки. Тщательное закрытие лучше для заживления ран; он также предотвращает остаточное кровотечение из раны и снижает риск членовредительства.
9. Компенсируют потерю жидкости подкожно 1-3 мл физиологического раствора в зависимости от количества периоперационного кровотечения.
10. Поместите елизаветинский ошейник на шею животного, и нанесите 2 свободных шва на кожу, чтобы сохранить ее в правильном положении.
11. Прекратите вдыхание изофлурана и постоянно наблюдайте за животным на согревающей подушке до полного сознания и амбулаторного состояния.

Рисунок 2:Периоперационное изображение перед врезки остеокожной конечности. Между паховым срезом и вставкой трансплантата над бедром сохраняется кожный мост примерно 1 см. Трансплантат помещается под мост, поддерживая его устойчивым для микрососудистого переноса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Послеоперационный уход

1. Наведите наблюдение за животным два раза в день в течение 72 часов, затем один раз в день до послеоперационного дня (POD) 7, а затем два раза в неделю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг должен быть адаптирован к состоянию животных и трансплантата (бледные глаза могут потребовать дополнительных жидкостей, окрашивание порфирином в качестве индикатора боли животных, аномальный цвет / температура трансплантата), и дальнейший уход должен быть обсужден с ветеринаром. Одиночное жилье требуется для крыс-реципиентов в течение всего периода исследования, чтобы избежать любого повреждения трансплантата.
2. Выполняйте обезболивание с подкожной инъекцией бупренорфина и/или нестероидного противовоспалительного препарата в соответствии с руководящими принципами IACUC.
3. Оцените трансплантат и ежедневно выполняйте физический осмотр с помощью снимков с использованием одного и того же устройства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование крема для удаления волос на коже трансплантата полезно для лучшей оценки цвета кожи трансплантата.

Результаты

В этом однооператорном исследовании было выполнено 30 сингенных гетеротопных частичных трансплантаций конечностей. Успех определялся на 21-й послеоперационный день как отсутствие неудачи ВКА или осложнений, требующих эвтаназии. Нормальная эволюция трансплантата представлена

Обсуждение

Ортотопические модели трансплантации конечностей у грызунов были описаны в литературе^15,16,17; однако они требуют восстановления нервов, повторного скрепления мышц и идеального остеосинтеза бедренной кости, что может быть очень трудным...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 GA angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381412
4-0 suture Black monofilament non absorbable suture	Ethicon	1667	Used to suture the E-collar to the back of the neck
4-0 suture Coated Vicryl Plus Antibacterial	Ethicon	VCP496
Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform	ASSI	ASSI.ATK26426
Bipolar cords	ASSI	228000C
Black Polyamide Monofilament USP 10-0, 4 mm 3/8c	AROSurgical	T04A10N07-13	Used to perform the microvascular anastomoses
Buprenorphine HCl	Pharmaceutical, Inc	42023-179-01
Dilating Forceps	Fine science tools (FST)	18131-12
Dissecting Scissors 15 cm, Round Handle 8 mm diameter, Straight Slender Tapered Blade 7 mm, Lipshultz Pattern	ASSI	ASSI.SAS15RVL
Double Micro Clamps 5.5 x 1.5 mm	Fine science tools (FST)	18040-22
Elizabethan collar	Braintree Scientific	EC-R1
Forceps 13.5 cm long, Flat Handle, 9 mm wide Straight Tips 0.1 mm diameter (x2)	ASSI	ASSI.JFL31
Halsey Micro Needle Holder	Fine science tools (FST)	12500-12
Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL	BD PosiFlush	306424
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Lone Star Elastic Stays	CooperSurgical	3314-8G	Used to retract the inguinal ligament for femoral vessels dissection
Lone Star Self-Retaining Retractors	CooperSurgical	3301G
Micro-Mosquito Hemostats	Fine science tools (FST)	13010-12	Used to retract the inguinal fat pad distally
Needle Holder, 15 cm Round Handle, 8 mm diameter, Superfine Curved Jaw 0.2 mm tip diameter, without lock	ASSI	ASSI.B1582
Nylon Suture Black Monolfilament 8-0, 6.5 mm 3/8c	Ethilon	2808G	Used to ligate collateral branches on the femoral vessels
Offset Bone Nippers	Fine science tools (FST)	16101-10
S&T Vascular Clamps 5.5 x 1.5 mm	Fine science tools (FST)	00398-02
Walton scissors	Fine science tools (FST)	14077-09