JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает стандартизированную оценку чувствительности лекарственного средства к целевым сигнальным ингибиторам в органоидных моделях, полученных от пациентов с НМРЛ.

Аннотация

Новые 3D-культуры органоидов рака, полученные из клинических образцов пациентов, представляют собой важную модельную систему для оценки внутриопухолевой гетерогенности и реакции лечения на целевые ингибиторы при раке. Новаторская работа в области рака желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы подчеркнула перспективность органоидов, полученных от пациента (PDO), в качестве системы культуры, близкой к пациенту, с появлением все большего числа моделей. Аналогичным образом, работа в других типах рака была сосредоточена на создании органоидных моделей и оптимизации протоколов культивирования. Примечательно, что 3D-модели органоидов рака поддерживают генетическую сложность оригинальных образцов опухолей и, таким образом, переводят данные секвенирования опухоли в лечение генетически информированными целевыми методами лечения в экспериментальных условиях. Кроме того, PDO могут способствовать оценке рациональных комбинированных методов лечения для преодоления резистентной адаптации опухолей в будущем. Последний фокусируется на интенсивных исследовательских усилиях при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ), поскольку развитие резистентности в конечном итоге ограничивает успех лечения целевыми ингибиторами. Ранняя оценка терапевтически целенаправленных механизмов с использованием ФДО НМРЛ может помочь в рациональном комбинированном лечении. В этой рукописи описывается стандартизированный протокол оценки чувствительности препарата к целевым ингибиторам в 3D-PDO, полученных из НМРЛ, с потенциальной адаптивностью к комбинированному лечению и другим методам лечения.

Введение

Персонализированные методы лечения онкогенных факторов произвели революцию в лечении рака, улучшив выживаемость пациентов и уменьшив побочные эффекты, опосредованные лечением1. Последние достижения в области молекулярной диагностики и технологий секвенирования подчеркнули сложность опухолей человека, причем пространственная и временная гетерогенность влияет на реакцию на лечение2. Повторение этих субклональных различий в моделях клеточных культур уже давно ограничивается исследованием отдельных изменений, представляющих интерес в однородных клеточных линиях. Недавно разработанные 3D-модели PDO, полученные из биопсии опухоли или хирургических резекций опухоли, позволяют улучшить представление клеточной сложности и передачу перекрестных помех в опухолевой ткани, полученной от пациента3. Таким образом, опухолевые органоиды, полученные из рака желудочно-кишечного тракта и поджелудочной железы, были успешно сгенерированы и повторяют генетическое разнообразие и детерминанты ответа на лечение4,5,6. При немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) признаются проблемы развития и становления органоидов, а также оптимизация методов культивирования и селективных медиа-факторов для обеспечения более широкого и систематического использования ПДО НМРЛ в будущем7,8.

Разработка комбинаторной терапии, нацеленной на остаточные опухолевые клетки, которые выдерживают первоначальное медикаментозное лечение, имеет важное значение для ингибирования развития резистентности и, в конечном счете, для улучшения выживаемости пациентов9. Учитывая архитектурную сложность органоидных культур, классические параметры лекарственного ответа должны быть оптимизированы, чтобы обеспечить точное и воспроизводимое тестирование чувствительности к лекарственным средствам. Показания на основе визуализации10,11 и классические анализы жизнеспособности клеток, измеряющие содержание клеточного АТФ6,12, среди других методов, доступны для профилирования реакций на лекарства в культурах PDO. Здесь мы разрабатываем и описываем стандартизированный протокол для оценки чувствительности лекарств к таргетной терапии против известных клинических факторов в моделях НМРЛ PDO.

протокол

Для исследований на людях было получено информированное согласие и проведен сбор тканей в соответствии с протоколами, утвержденными Советом по внутреннему обзору UCSF (IRB, протокол No: #13-12492 или CC#17-23309). Создание органоидных культур из деидентифицированных клинических образцов проводилось в сотрудничестве с партнерами по исследованию по ранее опубликованным методам13,14,15,16. Органоидные культуры были извлечены для экспериментов по поддержанию и эскалации наркотиков в проходе три или позже. Все следующие протоколы выполнялись в асептических условиях в лабораторной среде культивирования тканей млекопитающих.

figure-protocol-841
Рисунок 1: Схема протокола рабочего процесса и критические шаги в технике. (A) Экспериментальный рабочий процесс, включающий посев органоидов в формате 96 лунок, лечение эскалацией препарата через 7 дней после посева и считывание выживаемости клеток на основе люминесценции через 5 дней после обработки с использованием считывателя пластин ИФА. (B) Пример изображения EGFRdel19-положительных TH107 и EGFRL858R-положительных TH330 NSCLC органоидных культур. Показаны оригинальные культуры, клетки в момент посева (день 0) и органоиды при начале обработки через 7 дней после посева (7 день). Шкала шкалы = 100 мкм. Изменения диаметра органоидов в течение начального 7-дневного периода культивирования количественно оцениваются и указывают на > 2-кратное увеличение размера органоида. Относительные изменения размеров в 7-й день по сравнению со средним размером в день 0 представлены ниже репрезентативных изображений. Для TH107 наблюдается кратное изменение на 2,38 в течение 7 дней, что указывает на время удвоения 5,88 дня (141,12 ч). Для TH330 наблюдается сдвиговое изменение на 2,41 в течение 7 дней, что указывает на время удвоения 5,81 дня (139,42 ч). Представлена количественная оценка изменений размеров органоидов и статистическая оценка (справа). Статистическая значимость рассчитывается методом непарного t-теста, p < 0,0001. (C) Схема лечения для эскалации наркотиков в органоидном формате 96-луночной пластины. Указано количество технических реплик и примерных доз, включая отрицательный контроль. Схемы создаются с помощью BioRender, веб-инструмента иллюстрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Экспериментальные препараты

  1. Приготовьте питательную среду (ГМ), как сообщалось ранее15: питательную смесь F12 (DMEM/F-12) С L-аланил-L-глютамином, дополненной 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 10 мМ HEPES, 25 нМ гРспондином, 1x B27, 5 мМ никотинамида, 1,25 мМ N-ацетилцистеина, 500 нМ A-8301, 500 нМ SB202190, 50 мкг/мл Примоцина, 100 нг/мл гНоггина, 100 нг/мл hFGF-10, 25 нг/мл hFGF-7 (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно перемешайте, чтобы избежать вспенивания, и фильтруйте через систему фильтрации 0,22 мкм. Нагревайте среду до 37 °C в течение 1 ч перед использованием.
  2. Приготовьте среду с низким фактором роста (LGM), как сообщалось ранее16 , без добавления эпидермального фактора роста (EGF): питательная смесь F12 (DMEM/F-12), дополненная 1 мМ HEPES, 1x L-аланил-L-глутамином, 1x пенициллин-стрептомицин-глутамин, 10 мМ никотинамида, 1 мМ N-ацетилцистеина, 1x B27, 500 нМ A-8301, 100 нг/мл hNoggin.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно перемешайте, чтобы избежать вспенивания, и процедите через фильтр 0,22 мкм. Нагревайте среду до 37 °C в течение 1 ч перед использованием.
  3. Оттаивание BME2 (экстракт базальной мембраны с пониженным фактором роста, тип 2, см. Таблицу материалов) на льду при 4 °C в течение ночи.

2. Генерация одноклеточной суспензии и посев клеток

  1. Диссоциировать погруженную органоидную культуру BME2, как описано на следующих этапах (2.1.1-2.1.6).
    1. Тщательно аспирируйте среды из культуральных пластин. Избегайте прикосновения к погруженной в воду органоидной культуре BME2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация среды может быть выполнена так, как предпочитает исследователь, например, с помощью базовой системы аспирации жидкости или с использованием пипетки. Избегайте прикосновения к органоидам, встроенным в BME2, так как это может привести к потере органоидной биомассы.
    2. Трипсинизировать погруженную органоидную культуру BME2 подходящим рекомбинантным ферментом (см. Таблицу материалов). В формате плиты с 6 лунками добавьте 2 мл на лунку. Механически разрушайте BME2 путем многократного пипетирования вверх и вниз. Инкубировать пластины при 37 °C в инкубаторе клеточных культур в течение 5 мин.
    3. Переложите суспензию в 15 мл центрифужной трубки и центрифугу при 600 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Аспирировать рекомбинантный фермент осторожно, не прикасаясь к органоидной грануле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточный BME2 может присутствовать. При необходимости повторите переваривание фермента.
    5. Повторное суспендирование органоидной гранулы в ГМ (стадия 1.1). Добавьте ДНКазу I 1x 100 Ед/мл и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре (см. Таблицу материалов).
    6. Центрифуга при 600 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Пипетку аккуратно снять со среды, не касаясь органоидной гранулы и выбросить. Повторное суспендирование в свежем ГМ.
  2. Посев органоидной одноклеточной суспензии
    1. Предварительно нагрейте новую черную 96-луночную пластину с прозрачным дном при 37 °C в инкубаторе клеточных культур в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование прозрачных нижних пластин имеет важное значение для мониторинга роста органоидов и лекарственной реакции.
    2. Для подсчета подготовьте разбавление клеточной суспензии 1:5 в PBS (общий объем: 500 мкл) и подсчитайте клеточную суспензию с помощью клеточного анализатора (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно умножьте на коэффициент разбавления (х 5), чтобы получить конечную концентрацию клетки. Могут быть использованы альтернативные методы подсчета, такие как гемоцитометр. Жизнеспособность клеток следует контролировать с помощью анализа жизнеспособности окрашивания (например, с помощью Trypan Blue17). С помощью клеточного анализатора жизнеспособность оценивается автоматически. Жизнеспособность органоидных одноклеточных суспензий, оцениваемых клеточным анализатором, должна составлять ≥95% (дополнительный рисунок 1).
    3. Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимой для посева для эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация посева составляет 1500 клеток/мкл BME2, при этом на скважину необходимо 5 мкл BME2 (Общее количество: 7500 клеток/лунка). Для одной 96-луночной пластины требуется 6 x 10E5 ячеек. Это включает в себя посев 60 скважин с органоидными куполами (4,5 х 10E5) и экспериментальным излишком (расчет в общей сложности 80 скважин).
    4. Подготовьте одну аликвоту клеточной суспензии в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл на каждую 96-луночную пластину, которую планируется засеять, если в эксперимент включено несколько пластин из 96 скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные излишки и отдельные аликвоты на посеянную 96-луночную пластину необходимы для учета повышенного экспериментального смещения из-за обработки BME2.
    5. Ячейки аликвоты из одноэлементной суспензии, рассчитанной (этап 2.2.3) после тщательного повторного суспендирования путем пипетирования вверх и вниз. Пеллетные ячейки по 600 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите среду с помощью пипетки P200, не касаясь ячейки гранулы. Поместите ячейку гранулы на лед в ближайшее время (~1 мин) и повторно суспендируйте ячейку гранулы в BME2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточные среды могут поставить под угрозу структуру и жесткость BME2. Пипетка осторожно снимает все СМИ. Поместите клетки на лед в ближайшее время, чтобы акклиматизировать гранулу клетки и позволить ячейкам быть повторно суспендированными в BME2 без слипания. Держите BME2 на льду постоянно, чтобы он оставался в жидком состоянии. Для одной 96-луночной пластины необходимо 400 мкл BME2 для повторного суспендирования гранулы ячейки. Тщательно повторно суспендируйте клеточные гранулы, избегая введения пузырьков.
    6. Наклоните к себе предварительно нагретую черную 96-луночную пластину с прозрачным дном. Пластинчатые ячейки, использующие 5 мкл клеточной суспензии на скважину и посевные клеточные купола в положении «6 часов» каждой скважины (рисунок 1А).  Засейте клеточные купола в оставшихся внутренних колодцах (колонны 2-10 и ряды B-G плиты из 96 скважин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При обращении с BME2 рекомендуется обратная пипетка18 .
    7. Не перемещайте 96-луночную пластину и инкубируйте свежепосеянные клеточные купола в ламинарной вытяжке клеточной культуры в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем переместите пластину в инкубатор клеточной культуры и инкубируйте ее в течение 10 мин при 37 °C.
    8. Осторожно добавляйте 100 мкл ГМ на скважину ко всем скважинам, содержащим органоиды (колонки 2-10 и ряды B-G 96-луночной пластины). Добавьте 100 мкл PBS к наружным колодцам на краю пластины.
    9. Культивирование встроенных органоидов BME2 в ГМ-средах при 37 °C в инкубаторе клеточной культуры в общей сложности 7 дней. Регулярно осматривайте рост органоидов под световым микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к рисунку 1B и дополнительной таблице 1 для примера ожидаемого прогресса роста от посева до дня обработки.
    10. Смените среду один раз после 3-4 дней посева: поверните пластину по часовой стрелке на 180° (органоиды теперь в положении «12 часов»), осторожно аспирируйте ГМ из противоположного положения в органоидный купол с помощью многоканального аппарата, если таковой имеется, а затем добавьте свежий ГМ.

3. Медикаментозное лечение

  1. Приготовьте серийное разведение препарата в ЛГМ для препарата выбора, например, осимертиниба, для лечения EGFR-мутантных органоидов НМРЛ. Включите отрицательный контроль (LGM носитель + 0,1% DMSO). Подготовьте достаточное количество лекарственных аликвот всех доз в соответствии с количеством засеянных лунок плюс экспериментальный избыток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для целевых ингибиторов рекомендуется серия разведения, включающая дозы ≥8 и в диапазоне от 1 нМ-10 мкМ.
  2. Поверните органоидную пластину по часовой стрелке на 180° (органоиды теперь в положении «12 часов»). Осторожно аспирировать ГМ с помощью многоканального аппарата предпочтительно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикосновения к органоидному куполу во время аспирации ГМ, так как это может привести к потере органоидной биомассы и результатам воздействия.
  3. Добавляют 100 мкл контрольного (например, среды LGM + 0,1% ДМСО) или раствора препарата на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к рисунку 1С для схемы лечения эскалации наркотиков в формате 96-луночной пластины.
  4. Инкубировать обработанные органоиды при 37 °C в инкубаторе клеточной культуры в течение 5 дней.

4. Считывание с помощью анализа выживания на основе люминесценции

  1. Считывание урожая и выживания
    1. Выполните анализ на выживание в соответствии с Reference19.
      1. Реагент размораживания (см. Таблицу материалов) в течение ночи при 4 °C. Уравновешивают реагент на водяной бане комнатной температуры за 30 мин перед применением и перемешивают путем инвертирования.
      2. Добавьте равный объем реагента в каждую лунку (100 мкл на лунку). Тщательно перемешайте путем пипетки вверх и вниз, с наконечником пипетки, расположенным в положении купола органоида. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре в темное время суток.
      3. Используя многоканальную пипетку, перенесите приблизительно 75% (150 мкл) лизата (шаг 4.1.1.2) на новую белую непрозрачную 96-луночную пластину.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос 75% лизатов на новую пластину обеспечивает отсутствие пузырьков в более позднем считывании без влияния на чувствительность анализа.
      4. Инкубировать еще 25 мин при комнатной температуре в темное время суток.
    2. Запись люминесценции с помощью считывателя пластин ИФА (время интеграции 0,25-1 с/на лунку) (см. Таблицу материалов).
    3. Сохранять данные в соответствующем формате, например, таблицу данных, содержащую все необработанные считывания и записи макета пластины и используемых лекарств.
  2. Анализ данных с помощью программного обеспечения для статистического анализа (см. Таблицу материалов)
    1. Создайте новую XY-таблицу и вставьте данные в формате XY: строки (X) являются отрицательным контролем, за которым следуют возрастающие дозы лекарств, с дозами в качестве логарифма [ингибитора] в молярной концентрации. Столбцы (Y) — это значения считывания, которые включают реплики, сложенные вместе со столбцами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация отрицательного контрольного элемента должна быть указана как минимальное значение (заданное значение 0 невозможно в логарифмической шкале), например, log [Ингибитор], M = -10.
    2. Нормализуйте значения, выбрав Анализ > Нормализовать и используя следующие параметры: нормализуйте каждую подколонку отдельно, Y = 0 как 0 %, «последнее значение в каждой подколонке (или первое, в зависимости от того, что больше)» как 100 %, приводит в процентах, график результатов.
    3. Подогнать кривую нелинейной регрессии к нормализованным данным, выбрав Анализ анализов > XY > Нелинейная регрессия > Реакция на дозу - Ингибирование > log (ингибитор) vs . нормализованный ответ -- Переменный наклон.
    4. Отчет о результатах в виде таблицы значений IC50 , полученных после нелинейного регрессионного анализа, и графика кривой отклика, включая нормализованные точки данных в виде среднего +/- стандартного отклонения и подходящей кривой регрессии.

Результаты

Отмечены значительные проблемы в создании органоидов НМРЛ7. Таким образом, интересно наблюдать за недавней работой по созданию органоидов рака легких и использованию их для анализов лечения наркомании20,21,22. Мутации EGFR составляют 11,3% случаев НМРЛ23. Таргетное лечение ингибиторами EGFR представляет собой вариант лечения первой линии при EGFR-мутантном НМРЛ и улучшило общую выживаемость и безопасность лечения у пациентов24. Эта работа определила чувствительность к одобренному FDA ингибитору тирозинкиназы EGFR osimertinib24,25 в EGFR-мутантных органоидах НМРЛ. EGFR-мутантные органоиды НМРЛ были получены из образцов хирургической резекции или биопсии опухоли пациентов с НМРЛ и подтвердили наличие указанной онкогенной мутации путем секвенирования ДНК. Как указано выше, EGFR-мутантные модели органоидов НМРЛ обрабатывали возрастающими дозами осимертиниба и жизнеспособности PDO, оцениваемыми по показаниям выживаемости клеток на основе люминесценции через пять дней после начала лечения. В то время как EGFR мутантные (EGFRdel19)-положительные органоиды TH107 показали чувствительность к лечению осимертинибом с половинной максимальной ингибирующей концентрацией (IC50) 56 нМ (Рисунок 2A), EGFR-мутантные (EGFRL858R)-положительные органоиды TH116 были устойчивы к лечению осимертинибом с IC50 более 1 мкМ (Рисунок 2B). Чувствительность EGFRdel19-положительного TH107 НМРЛ сопровождалась значительными транскрипционными изменениями, включая снижение экспрессии сигнатур генов, связанных с клеточным циклом, и увеличение экспрессии сигнатур генов, ассоциированных с апоптозом (дополнительный рисунок 2A,B). В качестве справочной информации представлены данные ответа для чувствительной EGFRdel19-положительной линии NSCLC PC9 (рисунок 3A,B). Последний включает анализ выживаемости до возрастающих доз осимертиниба методом 2D люминесцентного анализа выживаемости (рисунок 3A) и изучение подавления сигнализации на уровне сигнализации EGFR-MAPK западным пятном (рисунок 3B). В целом, эти данные подчеркивают точность настоящего протокола для определения лекарственного ответа и разграничения чувствительных и устойчивых моделей PDO НМРЛ. Для определения возможных изменений, связанных с резистентностью, необходимы дальнейшие анализы EGFRL858R-положительного органоида TH116 и доступных клинических образцов.

figure-results-2888
Рисунок 2: Кривая ответа на лечение EGFR-мутантных органоидных моделей НМРЛ к эскалации осимертиниба. (A) Реакция осимертиниба в чувствительной органоидной модели TH107 TH107 NSCLC. (B) Реакция осимертиниба в резистентной EGFRL858R-положительной TH116 NSCLC органоидной модели. Точки данных представлены в виде нормализованных значений, показывающих среднее стандартное отклонение +/- со встроенной кривой нелинейной регрессии через данные. TH107, n = 6 технических реплик на точку данных. TH116, n = 4 технические реплики на точку данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3869
Рисунок 3: Сравнительные данные для ответа на лечение осимертинибом в чувствительной EGFR-мутантной клеточной линии НМРЛ и органоидных моделях, культивируемых в различных средах. (A) Реакция осимертиниба в чувствительной EGFRdel19-положительной клеточной линии НМРЛ PC9, определяемая стандартным анализом 2D-CTG. (B) Подавление сигнализации в клетках PC9 при двухдневном лечении осимертинибом (2 мкМ). (C) Реакция осимертиниба в чувствительной EGFRL858R-положительной TH330 NSCLC органоидной модельной культуре в LGM и ГМ-средах. (D) Реакция осимертиниба в резистентной органоидной модели AZ021 NSCLC в ЛГМ и ГМ-средах. Подтверждение онкогенной мутации EGFRL858R в AZ021 не удалось и может быть причиной отсутствия ответа осимертиниба. Для A и C-D точки данных представляются в виде нормализованных значений, показывающих среднее стандартное отклонение +/- с нелинейной кривой регрессии, проходящей через данные. PC9, n = 3 технические реплики на точку данных. TH330, n = 5 технических реплик на точку данных. AZ021, n = 6 технических реплик на точку данных. Тест на ранг Уилкоксона был выполнен на нормализованных данных для определения статистической значимости. Для TH330 (C), LGM против GM, ** p = 0,0078. Для AZ021 (D), LGM vs. GM, ns p = 0,0742. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Результаты репрезентативного клеточного анализатора для подсчета и оценки жизнеспособности EGFR-мутантных органоидных моделей. TH107 и TH107BC относятся к различным органоидным моделям, а A и B - к биологическим репликатам. Для каждой модели и биологической реплики подсчитываются три технические реплики; все они показывают жизнеспособность ≥95%. Справа представлено репрезентативное изображение во время подсчета клеток, показывающее устойчивую жизнеспособность и диссоциацию одиночных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Анализ обогащения генного набора (GSEA) с использованием объемных данных секвенирования РНК, полученных для EGFR-мутантных органоидов TH107 NSCLC, сравнение необработанного контроля (DMSO) и клеток, получавших осимертиниб в течение 3 дней (OSI_D3). (А-Б) При целенаправленном лечении чувствительные клетки подвергаются остановке клеточного цикла G1 и прекращают активную пролиферацию. Поскольку экспрессия генов клеточного цикла G2M связана с активной пролиферацией, ожидается номинальное обогащение экспрессии в необработанном контроле (DMSO). Для генов, связанных с апоптозом, ожидается номинальное обогащение в обработанных клетках (OSI_D3). Оба были подтверждены в EGFR-мутантной TH107 NSCLC органоидной модели, обработанной Осимертинибом: (A) GSEA для сигнатуры экспрессии Hallmark G2M (слева) показывает обогащение в клетках, обработанных DMSO. Номинальный показатель обогащения (NES): +1.708, FDR < 0.0001. (B) GSEA для сигнатуры экспрессии апоптоза Hallmark (справа) показывает обогащение в клетках, обработанных осимертинибом. NES: -1.075, FDR: ns, 0.3275. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Комбинаторное лекарственное лечение в EGFR-мутантной органоидной модели TH330, обработанной эскалацией осимертиниба в присутствии второго ингибитора добавки в фиксированной концентрации. Резистентно-ассоциированные изменения в EGFR-мутантном НМРЛ, т.е. активация SRC и AXL26,27,28, были фармакологически нацелены на комбинаторное лечение ингибитором SRC Saracatinib (100 нМ) или ингибитором AXL R428 (500 нМ), n = 6 технических реплик на точку данных. Оба комбинаторных лечения привели к увеличению ответа на лечение, что имело значение для комбинации Осимертиниба с ингибитором SRC Саракатинибом. Статистическая значимость оценивалась с помощью рангового теста Уилкоксона: Осимертиниб против Осимертиниба + Саракатиниба, *p = 0,0195; Осимертиниб vs. Осимертиниб + R428, нс, p = 0,2500. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Изменение размера органоида с посева (d0) на 7 дней после обработки (d7). (A) Развитие роста EGFRdel19-положительного органоида НМРЛ TH107. (B) Развитие роста EGFRL858R-положительного органоида НМРЛ TH330. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

Эта рукопись разрабатывает и описывает стандартизированный протокол оценки чувствительности к лекарственным средствам в 3D-моделях PDO, полученных из НМРЛ. В дополнение к исследованиям чувствительности к лекарственным средствам необходима дальнейшая характеристика доступных органоидных моделей для определения основных причин различий в чувствительности к лекарственным средствам. Это может включать генетическое профилирование органоидов и образцов пациентов и другие анализы, доступные для органоидов, такие как иммуногистохимическое окрашивание для маркеров дифференцировки и общих клеточных сигнальных биомаркеров и физиологии13,29.

Критические шаги в протоколе
Протокол, описанный в настоящем документе, обеспечивает стандартизированный рабочий процесс, который позволяет проводить точный и воспроизводимый анализ чувствительности к лекарственным средствам при тщательном соблюдении. Особую осторожность следует проявлять на следующих этапах: пищеварение TrypLE и DNAse I во время генерации одноклеточных суспензий, посев одноклеточных суспензий в BME2, мониторинг роста органоидов до лечения, изменения среды, а также нарушение и лизис встроенных органоидов BME2 во время считывания выживаемости клеток на основе люминесценции. (1) В то время как дополнительное переваривание DNAse I после диссоциации органоидов на основе TrypLE не является необходимым для расширения моделей органоидов во время регулярного поддержания культуры, пищеварение DNAse I не следует пропускать при посеве для экспериментов по эскалации лекарств, поскольку оно обеспечивает лучшее разделение кластеров органоидов на одноклеточные суспензии и точный подсчет клеток. (2) Посев одноэлементной суспензии в BME2 представляет собой критический этап с учетом затвердевания BME2 при комнатной температуре. Таким образом, необходимо сразу посеять максимум 1-2 ряда, а образцы поместить на лед перед посевом дополнительных рядов. Следует отметить, что клетки должны быть пипетированы вверх и вниз, когда посев продолжается, чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию. (3) Рост органоидов необходимо тщательно контролировать в течение 7-дневного расширения от посева до обработки. Пример ожидаемого развития приведен на рисунке 1В и в дополнительной таблице 1. Следует отметить, что оценка изменений в размерах органоидов с помощью микроскопии с ярким полем и анализа изображений, как представлено на рисунке 1B , может позволить точно оценить различия в росте органоидов и удвоении времени. Удвоение времени может повлиять на реакцию на наркотики, как недавно обсуждалось в литературе30. Если скорость роста органоидов значительно превышает представленный пример, можно рассмотреть возможность более короткого времени расширения до начала лечения и более короткой продолжительности лечения. (4) Кроме того, при смене среды следует проявлять особую осторожность, чтобы избежать аспирации органоидов. Посевное положение встроенных органоидов BME2 в положении «6 часов» обеспечивает безопасное аспирирование среды, когда пластины поворачиваются по часовой стрелке на 180°, а среда аспирируется в противоположном положении органоидов. (5) Наконец, тщательный лизис встроенных органоидов BME2 во время считывания выживаемости имеет важное значение для записи точных результатов. В соответствии с инструкциями производителя, образцы должны быть несколько раз пипетированы вверх и вниз, в идеале с использованием нефильтрованных наконечников, чтобы обеспечить надлежащий лизис. Время инкубации должно соблюдаться, как описано. Кроме того, перенос 75% лизата (вместо общего объема) на белую, непрозрачную нижнюю 96-луночную пластину для окончательного считывания с использованием считывателя пластин ИФА позволяет провести соответствующую оценку, поскольку это обеспечивает одинаковый объем в каждой скважине и отсутствие пузырьков воздуха, которые могут быть введены путем энергичного пипетирования.

Следует отметить, что профилирование реакций на лекарственные средства в органоидных культурах, встроенных в BME2, может показать более высокое стандартное отклонение, чем наблюдаемое в обычных культурах клеточных линий (рисунок 2, рисунок 3A). Более высокое стандартное отклонение основано на нескольких факторах, включая повышенную вероятность незначительных изменений в посеве при работе с BME2 и различия в отдельных темпах роста органоидов в скважинах в течение начального 7-дневного периода роста. Таким образом, должно быть посеяно равное или более четырех технических реплик на концентрацию лекарственного средства.

Самое главное, наличие злокачественных клеток, несущих онкогенную мутацию драйвера и ограниченное загрязнение нормальными эпителиальными клетками дыхательных путей, должно быть тщательно оценено. Проблемы в установлении НМРЛ могут способствовать росту нормальных эпителиальных клеток дыхательных путей7. Профилирование номеров копий или подходы на основе ПЦР и секвенирования для подтверждения наличия онкогенных мутаций драйвера являются методами выбора для обеспечения качества органоидных культур НМРЛ.

Модификации и устранение неполадок метода
Среды и соответствующие факторы роста, добавляемые к базовым медиа-решениям, могут значительно влиять на реакцию препарата на целевые ингибиторы. Они активируют байпасные рецепторы и сигнальные пути, которые влияют и ограничивают реакцию на препарат (например, FGF, HGF, EGF)26. В то время как богатая и адаптированная среда с фактором роста может быть оптимальной для расширения органоидной культуры, оценки эскалации и чувствительности к лекарственным средствам должны проводиться в средах с пониженным фактором роста, как описано выше. Это основано на внутреннем опыте сравнения различных составов сред и данных о реакции на лекарства (рисунок 3C). В то время как медиа-растворы могут влиять на степень чувствительности к определенному лекарственному лечению и могут смещать значения IC50 , устойчивые фенотипы чувствительности или резистентности очевидны независимо от состава среды (рисунок 3C, D). Кроме того, рекомендуется общая согласованность в составе среды и профилировании реакций на лекарства в органоидных культурах, и необходимо посеять равную или более четырех технических реплик на концентрацию. Это особенно важно для контрольных диапазонов чувствительности и чувствительности. резистентность к интересующему ингибитору.

Ограничения метода
Протокол, представленный здесь, описывает чувствительность 3D-моделей органоидов рака НМРЛ к целевым ингибиторам при культивировании раковых клеток, полученных от пациента. Дополнительные эксперименты, включая фармакодинамический анализ в отношении ингибирования путей и анализа секвенирования на наличие онкогена драйвера и вторичных мутаций, необходимы для детальной характеристики лекарственной устойчивости и чувствительности. Кроме того, побочные факторы, такие как стимулы микроокружения, полученные в результате взаимодействий или секретируемые нераковыми клетками-сторонними клетками в микроокружении опухоли, не учитываются, и необходимы новые протоколы, когда предпринимаются попытки кокультурных органоидных моделей с иммунными или стромальными клетками. Недавняя работа подчеркнула использование органоидных моделей для рекапитуляции взаимодействий микроокружения опухоли и профилирования ответов на ингибиторы иммунных контрольных точек, такие как лечение анти-PD-L1113,31.

Значимость метода по отношению к существующим/альтернативным методам
3D раковые органоидные модели рекапитулируют генетическое разнообразие и детерминанты ответа на лечение, присутствующие в исходной опухоли4,5,6. Примечательно, что пространственная и временная гетерогенность может способствовать эволюции опухоли, а параллельное возникновение и последовательное развитие субклонов опухоли может происходить32,33. Внутриопухолевая гетерогенность значительна для отбора более устойчивых опухолевых клеток под терапевтическим давлением9,34,35. Протокол, представленный здесь, позволяет быстро оценить чувствительность к лечению таргетными ингибиторами в образцах, близких к пациенту. Таким образом, органоидные модели имеют преимущества перед более традиционными гомогенными моделями клеточных линий, лишенными генетического разнообразия, или долгосрочными исследованиями с использованием клеточных линий или ксенотрансплантатов, полученных от пациента. Кроме того, настоящий протокол позволяет расширить масштаб до нескольких направлений лечения и комбинированных подходов к лечению с небольшими ограничениями в отношении стоимости и аналитического потенциала. Таким образом, добавление второго лекарственного средства, представляющего интерес, в фиксированной дозе при одновременном увеличении в первую очередь целевого ингибитора и сравнение его с эскалацией только основного целевого ингибитора позволяет эффективно оценивать потенциальные комбинаторные эффекты и с минимальной дополнительной биомассой, требуемой (дополнительный рисунок 3). По сравнению с оценками на основе визуализации, используемыми для мониторинга развития органоидов и реакции на лекарства, анализ выживаемости клеток на основе люминесценции, описанный здесь, имеет аналогичную чувствительность с минимальным оборудованием и требуемой подготовкой.

Важность и потенциал применения метода в конкретных областях исследований
Разработка стандартизированного конвейера, который позволяет устанавливать модели органоидов рака из образцов пациентов и последующее профилирование чувствительности к лекарственным средствам, обладает значительным потенциалом клинической применимости. Фармакологическое профилирование ex vivo получило признание при обнаружении уязвимостей и резистентных признаков в опухолях, коррелирующих с ответом на лечение у пациентов36,37. Примечательно, что профилирование чувствительности к лекарственным средствам ex vivo может помочь в выборе лечения в клинике и разработке рациональных комбинированных методов лечения, направленных на механизмы резистентности. В целом, этот подход может помочь обеспечить улучшенные персонализированные стратегии для молекулярной терапии или комбинаторных схем лечения. Последнее может помочь на раннем этапе нацелиться на механизмы лекарственной толерантности и резистентности и углубить клинический ответ для улучшения результатов лечения пациентов в будущем.

Раскрытие информации

T.G.B. является консультантом Array Biopharma, Revolution Medicines, Novartis, AstraZeneca, Takeda, Springworks, Jazz Pharmaceuticals, Relay Therapeutics, Rain Therapeutics, Engine Biosciences и получает финансирование исследований от Novartis, Strategia, Kinnate и Revolution Medicines.

Благодарности

Мы благодарим лаборатории Jeroen P Roose (UCSF) и Calvin J Kuo (Стэнфорд) за их вклад в развитие органоидной культуры и протокола. Мы также благодарим Огенекевве М. Гбендио (Лаборатория Руза, UCSF) за протоколы и ввод образцов. Этот исследовательский проект был проведен при поддержке NIH [U54CA224081]. Ф. Хадерк был поддержан постдокторской стипендией Милдред Шеель от Немецкой онкологической помощи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubes
15 mL centrifuge tubes
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon MembraneCorning430773for both media
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black MicroplateCorning3904
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom MicroplateCorning3917
A-8301Tocris Bioscience293910for both media
Advanced DMEM/F-12Gibco12634010for LGM
B27Life Technologies12587010for both media
BioRender 2021https://biorender.com/online scientific illustration software
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2)R&D Systems353301002
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG96823D-CTG readout reagent
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes
Deoxyribonuclease I (DNAse I)ThermoFisher Scientific18047019
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt SolutionCorningMT21031CV
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementGibco10565018for GM
GlutaMaxGibco35050061for LGM
GraphPad Prism software (version 9.2.0)GraphPadstatistical analysis software
HEPESGibco15630080for both media
hFGF-10PeproTech100-26-100ugfor GM
hFGF-7PeproTech100-19-50ugfor GM
hNogginPeproTech120-10C-100ugfor both media
hRspondinPeproTech120-38-100ugfor GM
Low retention pipette tips, 20 µL (P20)ThermoFisher Scientific2149P-05-HR
Low retention pipette tips, 200 µL (P200)ThermoFisher Scientific2069-05-HR
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000)ThermoFisher Scientific2179-HR
Multichannel pipette
N-AcetylcysteineFisher Scientific50-424-777for both media
NicotinamideSigma AldrichN0636-100Gfor both media
OsimertinibSelleck ChecmS7297
Penicillin-Streptomycin-GlutamineGibco10378016for LGM
Penicillin/StreptomycinCytiva HyCloneSV30010for GM
Pipettes (different sizes)
Plate readerMolecular DevicesSpectraMax M5equipment, alternative readers may be used
PrimocinInvivogenant-pm-1for GM
SB202190Selleck ChemS1077for GM
TrypLE Express EnzymeGibco12604021
Vacuum pump and tubing
Vi-CELL XR Cell AnalyzerBeckman CoulterVi-CELL XRcell analyzer / counter

Ссылки

  1. de Bono, J. S., Ashworth, A. Translating cancer research into targeted therapeutics. Nature. 467 (7315), 543-549 (2010).
  2. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  3. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  4. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  5. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
  6. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  7. Dijkstra, K. K., et al. Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine. Cell Reports. 31 (5), 107588(2020).
  8. Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  9. Bivona, T. G., Doebele, R. C. A framework for understanding and targeting residual disease in oncogene-driven solid cancers. Nature Medicine. 22 (5), 472-478 (2016).
  10. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955(2017).
  11. Tashiro, T., et al. In vivo and ex vivo cetuximab sensitivity assay using three-dimensional primary culture system to stratify KRAS mutant colorectal cancer. PLoS One. 12 (3), 0174151(2017).
  12. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  13. Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
  14. Hysenaj, L., et al. SARS-CoV-2 infection studies in lung organoids identify TSPAN8 as novel mediator. bioRxiv. , (2021).
  15. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  16. Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
  17. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocol in Immunology. , Appendix 3, Appendix 3B (2001).
  18. Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
  19. Promega Corporation. CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay. Promega Corporation. , (2021).
  20. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communication. 10 (1), 3991(2019).
  21. Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communication. 12 (1), 2581(2021).
  22. Shi, R., et al. Organoid cultures as preclinical models of non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (5), 1162-1174 (2020).
  23. Collisson, E. A., et al. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511 (7511), 543-550 (2014).
  24. Ramalingam, S. S., et al. Overall Survival with Osimertinib in untreated, EGFR-mutated advanced NSCLC. New England Journal of Medicine. 382 (1), 41-50 (2019).
  25. Soria, J. -C., et al. Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 378 (2), 113-125 (2017).
  26. Rotow, J., Bivona, T. G. Understanding and targeting resistance mechanisms in NSCLC. Nature Reviews Cancer. 17 (11), 637-658 (2017).
  27. Zhang, Z., et al. Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer. Nature Genetics. 44 (8), 852-860 (2012).
  28. Kanda, R., et al. Erlotinib resistance in lung cancer cells mediated by integrin β1/Src/Akt-driven bypass signaling. Cancer Research. 73 (20), 6243-6253 (2013).
  29. Bruun, J., et al. Patient-derived organoids from multiple colorectal cancer liver metastases reveal moderate intra-patient pharmacotranscriptomic heterogeneity. Clinical Cancer Research. 26 (15), 4107-4119 (2020).
  30. Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nature methods. 13 (6), 521-527 (2016).
  31. Yuki, K., Cheng, N., Nakano, M., Kuo, C. J. Organoid models of tumor immunology. Trends in Immunology. 41 (8), 652-664 (2020).
  32. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
  33. McGranahan, N., Swanton, C. Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution. Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).
  34. Rambow, F., et al. Toward minimal residual disease-directed therapy in melanoma. Cell. 174 (4), 843-855 (2018).
  35. Marine, J. C., Dawson, S. J., Dawson, M. A. Non-genetic mechanisms of therapeutic resistance in cancer. Nature Reviews Cancer. 20 (12), 743-756 (2020).
  36. Frismantas, V., et al. Ex vivo drug response profiling detects recurrent sensitivity patterns in drug-resistant acute lymphoblastic leukemia. Blood. 129 (11), 26-37 (2017).
  37. Drusbosky, L. M., et al. Predicting response to BET inhibitors using computational modeling: A BEAT AML project study. Leukemia Research. 77, 42-50 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

177PDOEGFR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены