Нацеливание на мышиные нейронные пластины с помощью внутриутробной наноинъекции (NEPTUNE) на эмбриональном дне 7.5

Резюме

В этом протоколе мы описываем, как ввести в амниотическую полость мыши при Е7.5 лентивирус, приводящий к равномерной трансдукции всей нервной пластинки, с минимальным пагубным воздействием на выживаемость или эмбриональное развитие.

Аннотация

Манипулирование экспрессией генов в развивающемся мозге мыши в утробе матери обладает большим потенциалом для исследований функциональной генетики. Однако ранее он в значительной степени ограничивался манипуляциями с эмбриональными стадиями после нейруляции. Был разработан протокол для введения в амниотическую полость в эмбриональный день (E)7,5 и доставки лентивируса, кодирующего кДНК или шРНК, нацеленного на >95% клеток нервной пластины и нервных гребней, способствуя будущему головному мозгу, спинному мозгу и периферической нервной системе. Этот протокол описывает этапы, необходимые для достижения успешной трансдукции, включая шлифование стеклянных капиллярных игл, проверку беременности, стадию развития с использованием ультразвуковой визуализации и оптимальные объемы инъекций, соответствующие эмбриональным стадиям.

Следуя этому протоколу, можно добиться трансдукции >95% развивающегося мозга высокотитерным лентивирусом и таким образом выполнить генетические манипуляции всего мозга. Напротив, можно достичь мозаичной трансдукции с использованием более низких вирусных титров, что позволяет проводить генетический скрининг или отслеживание родословной. Инъекция e7.5 также нацелена на эктодерму и нервный гребень, способствующие различным отделениям глаза, языка и периферической нервной системы. Таким образом, этот метод дает возможность манипулировать экспрессией генов в тканях, полученных из нейронных пластинок и эктодерм мышей на стадиях преневруляции, с преимуществом уменьшения числа мышей, используемых в экспериментах.

Введение

Головной и спинной мозг являются одними из первых органов, которые инициируют формирование во время эмбриогенеза ^1,2. Хотя гены, связанные с нарушениями развития нервной системы, идентифицируются, функциональный опрос генетических вариантов отстает от ^3,4. Поскольку генерация условных нокаутирующих мышей может занять месяцы или годы, альтернативный метод быстрого исследования функции генов в развивающемся мозге представляет интерес. У эмбрионов мышей нейруляция - морфогенетический процесс, посредством которого нервная пластинка превращается в нервную трубку, чтобы дать начало центральной нервной системе (ЦНС) - происходит между 8 и 10 днями после зачатия⁵. До начала нейруляции нервная пластинка, как часть эктодермы, состоит из одного слоя столбчатых клеток, которые будут размножаться и дифференцироваться в многочисленные типы нейронных и глиальных клеток в ЦНС ^6,7. Таким образом, чтобы экспериментально вызвать длительные изменения экспрессии генов в ЦНС, нацеливание на нейронную пластину предлагает очевидные преимущества, включая доступность всех клеток-предшественников.

В нейробиологии при электропорации ово ^8,9 и вирусной трансдукции эмбрионов мышей использовались для манипулирования экспрессией эмбриональных генов ЦНС. Развивающийся эмбрион цыпленка был моделью выбора для изучения функции генов во время развития спинного мозга из-за доступности эмбриона цыпленка в яйцеклетке и, как следствие, легкости манипулирования экспрессией генов. В частности, в овоплазмиде электропорация порождает экспериментальные и контрольные условия в спинном мозге каждого цыпленка. Электропорация вызывает пермеабилизацию клеточной мембраны и направляет отрицательно заряженную ДНК от (отрицательного) катода к (положительному) аноду, применяя электрический импульс через два электрода к эмбриону. У мышей внутриутробная электропорация обычно ограничивалась эмбриональными стадиями, на которых завершилась нейруляция, а головной или спинной мозг уже состоит из нескольких клеточных слоев, что приводит к низкой эффективности электропорации¹⁰. Плазмидная электропорация приводит к преходящей экспрессии генов и, как правило, нацелена на несколько клеток.

Ультразвуковая микроинъекция в утробе матери использовалась для манипулирования различными эмбриональными структурами, такими как кожа и мозг 11,12,13,14. Тем не менее, инъекции, нацеленные на развивающуюся мышиную ЦНС, показали низкую эффективность или негативно повлияли на эмбриональную выживаемость 12,13,14. Поэтому был разработан усовершенствованный протокол доставки высокотитерного лентивируса в амниотическую полость (AC) на E7.5, который был назван NEPTUNE для neural plate targeting with in uteronano-injection¹⁵. Инъекции привели к длительной целевой эффективности >95% всего мозга при E13.5. Кроме того, во время ультразвуковой проверки беременности был введен этап постановки для сортировки самок и беременностей по стадиям развития, чтобы свести к минимуму ненужные процедуры на исследуемых животных и максимизировать успех инъекций. Эффективность инъекций и выживаемость тесно связаны с увеличением размера переменного тока. Поэтому в этой статье описывается, как измерить размер ПЕРЕМЕННОГО тока перед инъекцией, чтобы доставить в АС подходящий объем, который не вызовет рассасывания эмбриона. NEPTUNE является надежной альтернативой современным внутриутробным подходам и может быть адаптирован для нескольких применений, включая, но не ограничиваясь, исследованиями получения и потери функции, отслеживанием родословной или скринингом ^15,16. 

протокол

Мыши дикого типа CD1 были размещены в соответствии с европейскими правилами, со стандартным дневным и ночным циклом с пищей и водой ad libitum. Самки CD1 спаривались с самцами CD1 в течение ночи, а вагинальные пробки проверялись утром (E0.3). Для инъекции использовались только беременные женщины. Этическое одобрение для всех экспериментов, описанных здесь, было предоставлено Шведским советом по сельскому хозяйству (Jordbruksverket).

1. Подготовка стеклянных игл: вытягивание и шлифовка иглой

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя предварительно измельченные иглы можно купить, вытягивание игл внутри компании позволяет легко регулировать длину иглы, отверстие и угол скоса.

1. Установите стеклянный капилляр в микропипетку/капиллярный съемник. Используйте следующие настройки с использованием указанного оборудования (см. Таблицу материалов): нагрев 580 единиц; скорость 140 единиц; время 200 единиц; давление 500-800 единиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Единицы измерения различных параметров определяются капиллярным съемником. Единицы измерения могут варьироваться для различного оборудования.
2. Нажмите Pull , чтобы раздвинуть капилляр, производя два стеклянных капилляра с коническими концами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После вытягивания кончики двух стеклянных капилляров закрываются из-за высокой температуры съемника микропипетки.
3. Отрежьте наконечник хирургическими ножницами, чтобы получить иглу длиной ~7 мм (измеренной от того места, где игла начинает сужаться) (рисунок 1А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для инъекций E7.5 длинная и тонкая игла имеет решающее значение, так как область инъекции очень маленькая и деликатная. Короткие и широкоствольные иглы приведут к эмбриональной смерти.
4. Шлифуйте нарезанный кончик иглы, чтобы создать острый скос (рисунок 1С-Ф).
   1. Шлифуйте иглу под углом 20° на максимальной скорости в течение не менее 30-45 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сверхчистая вода добавляется в шлифовальную пластину, чтобы действовать как смазка, снижать трение / температуру и смывать частицы стекла (рисунок 1B). Однако избыток жидкости может замедлить работу измельчителя.
   2. Убедитесь, что наконечник иглы (рисунок 1C) касается поверхности шлифовальной пластины (рисунок 1D), но не изгибается (рисунок 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гнутое шлифование приводит к длинному и хрупкому кончику иглы с неправильным углом скоса, который может легко сломаться во время инъекции. Разрыв игл может нанести вред эмбриону и должен быть заменен неповрежденной иглой. Правильно заземленный наконечник показан на рисунке 1F,G. Ожидается, что после измельчения полученное игольчатое отверстие будет иметь внутренний диаметр (ID) ~15 мкм и наружный диаметр (OD) ~35 мкм (рисунок 1G).
5. Наполните шприц объемом 1 мл минеральным маслом и прикрепите иглу весом 27 г.
6. Снимите колпачок иглы и вставьте иглу шприца в только что измельченный стеклянный капилляр. Впрыскивайте минеральное масло до тех пор, пока масло не капит с кончика капилляра. Продолжайте вводить, вынимая иглу весом 27 г, пока капиллярная игла не будет заполнена минеральным маслом, после чего игла шприца может быть удалена.
7. Храните измельченные и наполненные минеральным маслом иглы в закрытой среде, чтобы предотвратить повреждение и накопление пыли. Для хранения вставьте два рулона пластилина в обычную чашку Петри, чтобы она служила держателями (рисунок 1H). Аккуратно посадите иглы на глину и разместите их далеко друг от друга для легкого извлечения игл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку подготовка иглы занимает много времени, лучше всего готовить иглы по крайней мере за один день до инъекций. Выбросьте хвою максимум после двух пометов, так как они станут тупыми. Всегда готовьте резервные иглы на случай повреждения иглы во время подготовки или инъекции.

Рисунок 1: Подготовка иглы для инъекций в амниотическую полость E7.5. (A) Репрезентативные примеры вытянутой, но неразрезанной стеклянной капиллярной иглы (слева), капиллярной иглы, разрезанной на оптимальной длине для инъекций E7.5 (посередине), и капилляра, разрезанного слишком коротко (справа). (B) Шлифовальная машина с равномерным покрытием воды, которая готова к шлифовке иглой. (С-Ф) Репрезентативные примеры различных кончиков игл. (C) Разрезанный, но не измельченный наконечник иглы, установленный в шлифовальной машине; (D) идеальное положение шлифования с наконечником иглы, просто касающимся шлифовальной машины; (E) игла опускается слишком далеко и изгибается в процессе шлифования; (F) идеальный молотый наконечник иглы для инъекций E7.5 AC. (G) Наконечник шлифовальной иглы с отверстием с внутренним диаметром ~15 мкм и наружным диаметром ~35 мкм, который подходит для впрыска E7.5 AC. Отверстие иглы отображается в виде пунктирных линий. Наружный диаметр обозначается красными наконечниками стрелок; внутренний диаметр обозначен синими наконечниками стрел. (H) Хранение иглы: чашка Петри, наполненная вытянутыми и измельченными иглами. Два ряда лепной глины служат держателями. ПРИМЕЧАНИЕ: Для глазного микрометра в C, F, G, 1 см делится на 100 шагов; цель 3x; таким образом, 1 шаг = 10 000 мкм/(100 × 3) ≈ 33,4 мкм. Сокращения: AC = амниотическая полость; ID = внутренний диаметр; OD = наружный диаметр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. За день до инъекции: подготовьте скамейку для ультразвуковой проверки беременности

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы должны проводиться в вентилируемом стенде уровня биобезопасности 2 (BSL 2) при работе с лентивирусом. Ультразвуковая проверка беременности может проводиться на вентилируемой скамье.

1. Включите ультразвуковой аппарат, нагревательный стол и источник питания O₂ для насоса изофлурана (может варьироваться в зависимости от оборудования).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте систему изофлурана, чтобы убедиться в отсутствии утечки изофлунана в воздух.
2. Поместите пустой мешок для отходов (приклеенный к внутренней стене для легкого доступа), крем для удаления волос, стерильные упакованные ватные тампоны, воду, папиросную бумагу и хирургическую ленту внутри скамейки BSL 2.
3. Подготовьте четыре кусочка хирургической ленты (~ 7 см длиной), чтобы закрепить конечности мыши во время ультразвуковой проверки беременности.

3. Ультразвуковая проверка для подтверждения беременности

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен за день до инъекций E7.5, при E6.5. Смотрите обсуждение для получения подробной информации о проверке на гестационный возраст.

1. Поместите спаренную во времени самку мыши в индукционную камеру.
2. Включите газовый поток с потоком кислорода ~2,1 л/мин и начальной дозой 3-4% изофлурана, чтобы вызвать анестезию.
3. Убедитесь, что самка полностью обезболена, проверив рефлекс лапы. Если рефлекс лапы отсутствует, снижают изофлуран до 1,5-2%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется около 3 минут, чтобы вызвать анестезию.
4. Переключите поток газа из индукционной камеры на носовой конус нагревательного стола.
5. Поместите обезболенную самку в положение лежа на спине (живот вверх) на нагревательном столе и поместите морду в прикрепленный носовой конус, чтобы обеспечить поддержание анестезии во время ультразвуковой проверки беременности.
6. Прикрепите все четыре лапы к столу подготовленными кусочками хирургической ленты, не растягивая тело самки и не захватывая усы.
7. Нанесите крем для удаления волос размером с горошину на нижнюю часть живота. Используя ватный тампон, распределите крем по нижней части живота (квадрат ~ 3 х 3 см) и нежно вмассируйте его, катая ватный тампон вперед и назад.
8. Как только мех начнет отделяться от кожи, смочите папиросную бумагу и удалите крем и мех. Очистите очищенную от шерсти область влажной папиросной бумагой, пока все кремы и волосы не исчезнут. Высушите кожу.
9. Нанесите количество ультразвукового геля размером со сливу на выбритую область и приступайте к идентификации матки с помощью ультразвука с помощью любого из следующих трех подходов.
   1. Для этого вручную проведите ультразвуковой зонд в ультразвуковом геле и переместите зонд, чтобы найти матку.
   2. Для полумануального подхода No1 расположите ультразвуковой зонд (прикрепленный к перильной системе) над животом самки, ослабив и переместив часть рельса вдоль плоскости X. Опустите ультразвуковой зонд в гель (z-плоскость) и просканируйте нижнюю часть живота (y-плоскость) (рисунок 2A).
   3. Для полумануального подхода No 2 опустите ультразвуковой зонд (прикрепленный к перильной системе) в гель, чтобы получить изображение нижней части живота. Держите ультразвуковой зонд неподвижным во время процесса и перемещайте нагревательный стол с прикрепленными колесами вдоль x и/или y-плоскостей (рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этих ранних эмбриональных стадиях внутренние органы, например, кишечник, могут казаться похожими на матку при ультразвуковой визуализации. Однако, в то время как эмбрионы и децидуа появляются в виде последовательности сфер (сродни бусинам вдоль ожерелья), кишечник имеет вид непрерывной трубки. Связность просветных пространств (отдельные сферы против непрерывной трубки) может быть оценена путем сканирования вперед и назад через интересующую структуру, чтобы определить, является ли структура дискретной сферой (эмбрион / децидуа) (рисунок 2C) или непрерывной трубкой (кишечник) (рисунок 2D). На этом этапе нет необходимости записывать количество эмбрионов; достаточно подтвердить их наличие или отсутствие.
10. Как только состояние беременности определено, поднимите ультразвуковой зонд от живота и протрите нижнюю часть живота влажной папиросной бумагой, чтобы удалить ультразвуковой гель.
11. Выключите насос изофлурана и снимите хирургическую ленту, чтобы освободить лапы.
12. Поместите самку в положение лежа (живот вниз) в чистую клетку на нагревательной пластине с температурой 40 °C. Держите самку под пристальным наблюдением, пока она не придет в сознание, что занимает 2-6 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ультразвуковая проверка для одной женщины составляет <10 минут, чтобы свести к минимуму воздействие изофлурана.
13. Удалите все материалы и отходы и очистите все поверхности 70% этанолом. Протрите все остатки ультразвукового геля с ультразвукового зонда сухой, мягкой и безворсовой бумажной салфеткой. Выключите ультразвуковой аппарат, вентилируемый стенд / стенд BSL2, нагревательный стол и блок питания O₂ .

4. Ультразвуковая проверка на стадию эмбриона

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется перед операцией и служит для стратификации беременных женщин в соответствии с их размерами AC. Этот шаг имеет решающее значение на E7.5, когда цель состоит в том, чтобы нацелиться на развивающуюся ЦНС. На этой ранней стадии развития разница в несколько часов в развитии существенно влияет на размеры АС и прогрессирование нейруляции.

1. Обезболить первую беременную самку мыши, выполнив шаги 3,1-3,5.
2. Поместите и зафиксируйте самку на столе, как описано в шаге 3.6.
3. Нанесите количество ультразвукового геля размером со сливу на бритый живот и опустите ультразвуковой зонд, чтобы получить изображение нижней части живота женщины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предполагает, что самка была осмотрена ультразвуком на предыдущий день беременности и уже удалила мех на животе. Если это не так, мех необходимо удалить перед добавлением ультразвукового геля, выполнив шаги 3,7-3,8. При Е7.5 матка и децидуа больше и их легче отличить от внутренних органов. Кроме того, АС больше и его можно отличить от экзоцеломной полости (ExC).
4. Просканируйте левые и правые рога матки как можно полнее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые эмбрионы лежат глубже внутри тела самки и могут быть пропущены.
5. Запишите количество и стадии эмбрионов. Запишите количество околоплодных полостей идеального размера, допустимых полостей и децидуа без полости (рисунок 2E-G).
6. Организуйте все беременности и ранжируйте их соответствующим образом.
7. Вводите женщинам большинство кондиционеров идеального размера сразу после ультразвуковой проверки (шаг 4.4), следуя инструкциям в шагах 4.5-4.7.
8. Для самок с большинством допустимых (в которых экзоцеломическая и амниотическая полости еще четко не разделены на две полости) или отсутствующих полостей, отложите инъекции и повторите их через пару часов. Если большая часть полостей еще слишком мала, отложите инъекции на 10-12 ч.

Рисунок 2: Осмотр и постановка амниотических полостей во время ультразвуковой проверки. (А) Обзор рельсовой системы с прикрепленным ультразвуковым зондом, наноинжектором и нагревательным столом. Ультразвуковой зонд может перемещаться в плоскостях x, y и z для достижения оптимального выравнивания с женским животом или кондиционерами. (B) Нагревательный стол может перемещаться с помощью двух колес в x- и/или Y-плоскостях, чтобы обеспечить точное сканирование и оценку кондиционеров, в то время как ультразвуковой зонд может оставаться статическим. (C) Репрезентативные ультразвуковые изображения E6.5 deciduas внутри женской брюшной полости во время ультразвуковой проверки для подтверждения беременности (белые пунктирные контуры). На данный момент полости не образовались; однако иногда виден эктоплацентарный конус (белые звездочки). Децидуас можно распознать по их сферической форме и отличить от кишечника, который выступает в виде одной сплошной трубки. (D) Репрезентативная последовательность изображений тонкой кишки (белые пунктирные контуры), которая непрерывна при сканировании нижней части живота. (Е-Г) Репрезентативные ультразвуковые изображения во время постановки полости перед инъекциями Е7.5. Амниотическая и экзоцеломическая полости образовались и разделены амнионом. Эктоплацентарный конус служит основным кровоснабжением и появляется как яркое пятно на УЗИ. АС наиболее дистальный от эктоплацентарного конуса. (E) Ак идеального размера кажутся больше, чем экзоцеломная полость, в то время как полости среднего размера кажутся меньше (F). Если полости не видны (G), это означает, что эмбрион либо резорбирован, либо еще не достиг E7.5. Шкала брусков = 1 мм. Аббревиатуры: A = Amnion; AC = амниотическая полость; ExC = экзоцеломная полость; EC = эктоплацентальный конус. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. День инъекции: подготовьте скамейку BSL2 к операции

1. Приклейте один кусок эластичной мембраны к круглому центральному отверстию коммерчески доступной модифицированной чашки Петри. Убедитесь, что мембрана хорошо прикреплена к чашке Петри, чтобы предотвратить утечку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если тарелка становится протекающей или плохо приклеивается, края эластичной мембраны могут быть дополнительно закреплены клейкой лентой.
2. Сделайте разрез длиной 1-1,5 см в центре эластичной мембраны.
3. Включите ультразвуковой аппарат, стенд BSL2, нагревательную пластину, блок питания O₂ для насоса изофлурана и стерилизатор из стеклянных шариков (установлен на 300 °C).
4. Внутри скамейки BSL2 поместите один пустой мешок для мусора (приклеенный к внутренней стене для легкого доступа); стерильные упакованные ватные тампоны (используйте новый для каждой операции / каждой женщины); хирургические инструменты (ножницы, пинцет, клипсы, шов) и хирургическая лента; одна полная бутылка фосфатно-буферного физиологического раствора комнатной температуры (PBS), одна пустая бутылка для сбора отходов и одна пипетка объемом 25 мл; одна чашка Петри с эластичной мембраной для хирургии; крышка чашки Петри с куском парапленки размером 2 х 2-3 х 3 см, закрепленным на крышке каплей воды; лепка из глины: 4 больших шара или куба (~3 x 3 x 3 см3) и один цилиндрический кусок (~4 x 1 см); шприц с анальгетиком (например, бупренорфином, 0,05-0,1 мг/кг массы тела) и гелем для глазПРИМЕЧАНИЕ: Шарики (или кубики) лепной глины будут служить «ногами» или подставками/держателями для чашки Петри, как только чашка будет помещена на брюшко самки. Цилиндрический кусок глины закрепляет эмбрионы внутри тарелки. Если вводится более одного раствора или иглу необходимо повторно заполнить во время инъекций, можно использовать один и тот же кусок парапленки, если растворы могут быть разделены друг от друга.

6. Загрузка иглы

1. Протрите все излишки минерального масла папиросной бумагой для лучшего захвата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда очищайте от наконечника, чтобы предотвратить повреждение или травму.
2. Убедитесь, что все компоненты (одно уплотнительное кольцо, одна прокладка и одна передняя прокладка, размещенные под цангой, рисунок 3А) установлены в правильной ориентации (рисунок 3B, цанга удалена для визуализации), чтобы удерживать капиллярную иглу на месте и создавать герметичное соединение, избегая образования пузырьков при продвижении или втягивании металлического плунжера внутри иглы.
3. Убедитесь, что металлический плунжер наноинжектора полностью втянут. Проверьте, нажав клавишу Fill , и дождитесь двойного звукового сигнала, указывающего на то, что плунжер полностью втянут.
4. Когда цанга прикреплена, но слегка ослаблена (откручена на 45-90 градусов), сдвиньте стеклянную иглу на металлический плунжер и протолкните капиллярную иглу вместе с металлическим плунжером через переднюю прокладку, пока она не достигнет распорки (рисунок 3C, D, цанга удалена для визуализации).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторое сопротивление появляется, когда плунжер проходит через прокладку, и уменьшается, когда он достигает распорки. Убедитесь, что капиллярная игла прочно вставлена в распорку для создания герметичного соединения (рисунок 3D).
5. Закрепите иглу, затянув цангу наноинжектора (надежно завинтите назад).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не перетягивайте, так как это может раздавить иглу.
6. Нажмите Empty , чтобы втолкнуть поршень в иглу и вытолкнуть масло из кончика иглы. Если стеклянная игла движется, уберите поршень, извлеките иглу и перезагрузите. Если это приводит к образованию пузырьков воздуха, удалите иглу и заправьте минеральным маслом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно закрепленная игла не должна двигаться вместе с плунжером.
7. Поместите каплю вируса (~ 6 мкл) или другой инъекционный раствор на кусочек парапленки¹ (фиг.3Е; Синий краситель Эванса используется в целях визуализации).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальный объем наноинжектора составляет ~5 мкл.
8. Нажмите Fill, чтобы создать воздушный пузырь, служащий разделителем между маслом и раствором (рисунок 3F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это также служит маркером позиционирования при заполнении или опорожнении иглы.
9. Опустите иглу, погрузите наконечник в раствор и нажмите Fill (рисунок 3F,G).
10. Следите за уровнем жидкости, когда раствор загружается после пузырька воздуха. Нажмите Empty , чтобы изгнать засор и перезагрузиться, нажав Fill , если пузырь воздуха становится удлиненным без попадания жидкости в иглу. Если это не решит проблему, поменяйте иглу.
11. Когда игла будет полностью загружена (рисунок 3H), поднимите иглу в z-плоскости и аспирируйте небольшой объем воздуха на кончике, чтобы предотвратить испарение раствора на кончике иглы и засорение иглы.
12. Поверните наноинжектор с прикрепленной иглой подальше от оператора, к задней части скамьи, чтобы предотвратить любое случайное повреждение или травму.

Рисунок 3: Прикрепление иглы к наноинжектору и загрузка раствора. (A) Исходное положение перед установкой иглы на наноинжектор: металлический плунжер полностью втянут и цанга прикреплена. (B) Под цангой все три компонента для удержания и закрепления иглы показаны в правильном порядке (слева направо): уплотнительное уплотнительное кольцо (тонкое и черное), распорка (белый), уплотнительное кольцо (черное) с большим отверстием (через которое должна проходить игла). Чтобы обеспечить герметичное соединение, стеклянную иглу скользят по металлическому плунжеру (C) и проталкивают через отверстие переднего уплотнительного кольца до тех пор, пока оно не достигнет распорки (D). (Э-Н) Загрузка раствора в иглу. (E) Одну каплю раствора помещают на кусок парапленки на крышке пластины. (F) Создайте пузырь воздуха, нажав fill перед загрузкой раствора и погрузив кончик иглы в раствор. (G) Раствор загружается в иглу. (H) Раствор загружается в иглу. ПРИМЕЧАНИЕ: Цанга была удалена в (B-D) для визуализации, но должна оставаться прикрепленной во время экспериментов. Заключительным этапом закрепления иглы является затягивание цанги. Синий краситель Эванса используется для визуализации в E-H. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

7. Инъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты, используемые в этой процедуре, стерилизуются перед операцией и между каждой мышью.

1. Обезболить первую самку с полостями идеального размера (см. раздел 4).
2. Поместите и зафиксируйте самку на столе, как описано в шагах 3.1-3.6.
3. Нанесите гель для глаз на глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы, и введите болеутоляющее средство подкожно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые анальгетики: бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг массы тела) или флуниксин (2,5 мг/кг) или аналогичные в соответствии с местными правилами защиты животных. Мультимодальная периоперационная анальгезия поддерживается инъекционными анальгетиками и изофлураном.
4. Асептически подготовьте нижнюю часть живота, протирая тканью, пропитанной раствором хлоргексидина 0,5 мг/мл (или аналогичным), и высушите кожу. Используйте хирургические ножницы, чтобы сделать вертикальный разрез кожи средней линии 1,5-2,0 см в нижней части живота.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте хирургическую зону в соответствии с местными одобренными процедурами дезинфекции.
5. Осторожно поднимите кожу и освободите кожу от нижележащего мышечного слоя, примерно на 1 см вокруг точки разреза, чтобы облегчить наложение швов после операции.
6. Сделайте вертикальный разрез средней линии 1 см в мышечном слое.
7. С помощью пары щипцов поднимите одну сторону кожи и мышечного слоя, а другой парой ищите маточные рога.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Децидуа расположены как бусины на ожерелье, в то время как кишечник представляет собой одну длинную, непрерывную трубку (рисунок 4А).
8. С помощью щипцов осторожно вытащите оба рога матки из живота. Удерживать ткани между эмбрионами; не сжимайте их напрямую (рисунок 4B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Матка прикреплена к телу в шейке матки, а два яичника / яйцеводов прикреплены через связки. Не вытягивайте/отсоединяйте матку от этих опорных точек.
9. Подсчитайте и запишите количество эмбрионов с левой и правой стороны.
10. Пронумеруйте эмбрионы либо от яичника до шейки матки, либо от шейки матки до яичника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это особенно важно, если введенные эмбрионы будут собраны на эмбриональных стадиях.
11. С помощью влажного ватного тампона осторожно протолкните все эмбрионы обратно в брюшную полость, за исключением первых трех, которые будут введены.
12. Поместите каплю PBS на резинку в чашке Петри и держите ее непосредственно над эмбрионами.
13. Вставьте закрытые щипцы в разрез резинки и отпустите щипцы, чтобы открыть упругий разрез, чтобы жидкость упала на эмбрионы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает регидратацию эмбрионов и то, что эластичная мембрана прилипает к влажной коже самки, предотвращая утечку PBS на следующих этапах.
14. Вытяните участок матки, соответствующий трем эмбрионам, через резинку с щипцами и аккуратно посадите чашку Петри на брюшко самки.
15. С помощью щипцов и влажного ватного тампона отрегулируйте положение матки и резинку, чтобы убедиться, что резинка герметизирована к коже самки, чтобы предотвратить утечку PBS.
16. Используйте четыре глиняные ноги, чтобы закрепить и закрепить чашку Петри непосредственно над животом, уменьшая давление на женщину и чувствительность визуализации к дыханию и сердцебиению женщины.
17. Прижмите моделирующий глиняный цилиндр справа от эмбрионов/матки, чтобы зафиксировать матку (рисунок 4C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инструкция по ориентации предполагает, что игла находится слева от самки и что эмбрионы левого рога матки женщины обнажаются. Сторона матки (левый или правый рог матки) имеет решающее значение, так как AC либо обращен к игле (левый рог; Рисунок 4D) или обращен к стабилизирующему глиняному цилиндру (правый рог; Рисунок 4Е).
18. Чтобы ввести эмбрионы из правого рога матки, поместите глиняный цилиндр на левую сторону эмбрионов (рисунок 4F) и поверните нагревательный стол на 180° (рисунок 4G) для достижения правильной ориентации. Если иглу можно перемещать, адаптируйте ее соответствующим образом для соответствующей установки.
19. Добавляйте PBS в чашку Петри до тех пор, пока эмбрионы и матка не будут покрыты PBS.
20. Опустите ультразвуковой зонд в PBS и отрегулируйте таблицу мыши / хирургии так, чтобы первый эмбрион был выровнен с ультразвуковым зондом, чтобы облегчить запись инъекций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: «Первый» относится к нумерации эмбрионов от яичника до шейки матки.
21. Просканируйте все три эмбриона и осмотрите кондиционеры. Определите объем инъекции следующим образом:
    1. Измерьте диаметр переменного тока с помощью ультразвукового аппарата. Впрыск 69 нЛ, если диаметр переменного тока составляет ≤0,2 мм; впрыск 2 x 69 нЛ (= 138 нЛ), если диаметр переменного тока составляет >0,2 мм и ≤0,29 мм; и впрыскивать 3 x 69 нЛ (= 207 нЛ), если диаметр переменного тока > 0,29 мм (рисунок 4H).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие эксперименты показали, что до 207 нЛ инъекционных объемов хорошо переносятся при E7.5¹⁵. Успешные инъекции с минимальным влиянием на выживаемость достигаются тогда, когда относительное увеличение объема АС не превышает 90%¹⁵. Изменение размера переменного тока между однопометниками или штаммами мышей является распространенным явлением и может потребовать дальнейшей оптимизации.
22. Установите объемы впрыска с помощью контроллера впрыска.
23. Установите скорость впрыска на замедление со скоростью впрыска 23 нл/с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные модели оборудования могут привести к различным силам впрыска.
24. Опустите иглу в PBS, используя основные колеса на рельсовой системе (x- и z-плоскости, рисунок 4I) и нажмите Empty на контроллер наноинжектора, пока жидкость не достигнет кончика иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла засорилась, нажатие Empty может растворить засор и/или изгнать засор.
25. Выньте иглу из PBS и нажмите Кнопка впрыска. Убедитесь, что капля приблизительного желаемого объема разряжена.
26. Опустите иглу в PBS и выровняйте ее с ультразвуковым зондом и эмбрионом, переместив наноинжектор с помощью колеса Y-плоскости на микроманипуляторе (рисунок 4J).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кончик иглы идеально выровнен, когда он выглядит как яркое пятно на ультразвуковом изображении (рисунок 4K, L). Иглу можно перемещать во всех трех плоскостях направления с помощью микроманипулятора.
27. Отрегулируйте угол иглы с помощью колеса угла впрыска, чтобы обеспечить почти перпендикулярный угол инъекции относительно стенки матки. Вставьте иглу в переменный ток одним движением с помощью инжекторного колеса на микроманипуляторе (рисунок 4J-M). Следите за яркостью кончика иглы. Если кончик иглы исчезает с ультразвукового изображения, переместите ультразвуковой зонд вперед или назад, чтобы вернуть иглу в фокус.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только игла находится внутри ac, незначительные изменения в положении и фокусе иглы могут быть сделаны без вреда для эмбриона (корректировки в пределах ~ 0,3 мм). Не регулируйте положение иглы больше, чем это.
28. Нажмите Inject (для 207 нЛ установите объем на 69 нЛ и введите три раза). После инъекции подождите еще 5-10 с, прежде чем втягивать иглу одним плавным движением.

Рисунок 4: Оптимальный размер и ориентация амниотической полости для успешных инъекций. (А) Рог матки с несколькими децидуами Е7,5, по форме напоминающий цепочку сфер (снизу) по сравнению с толстой кишкой (сверху). (B) Захват ткани матки (белые пунктирные линии) между децидуами. Избегайте сдавливания децидуа (белых наконечников стрел) непосредственно щипцами, так как децидуа и развивающиеся эмбрионы хрупки на этой ранней стадии и склонны к рассасыванию при чрезмерной внешней силе. (C) Самка в положении лежа на спине с децидуасом, выставленным в чашке Петри, заполненной PBS и установленной на четырех футах пластилина для моделирования. Децидуа стабилизируются дополнительным куском пластилина, имеющим форму цилиндра. (Д, Д) На ориентацию АС влияет сторона рога матки, которая подвергается воздействию. Если использовать децидуа из левого рога матки, кондиционер будет обращен в сторону от глиняного стабилизатора и будет легко доступен для иглы слева (D). Однако, если используется правый рог матки, эктоплацентарный конус вместо этого будет обращен к игле, что затрудняет доступ к AC (E). Поэтому при введении в правый рог матки глиняный стабилизатор помещается в сторону, обращенную к игле (F), а весь нагревательный стол поворачивается на 180° (G). (H) Рекомендуемые объемы впрыска в соответствии с размерами переменного тока. В общем, полости диаметром ≤ 0,2 мм могут быть введены максимум 69 нЛ. Диаметры > 0,2 мм и ≤ 0,29 мм допускают объемы до 2 x 69 нЛ (138 нЛ) и полости > 0,29 мм могут быть введены с 3 x 69 нЛ (207 нЛ). Шкала стержней = 1 мм. (I, J) Наноинжектор прикреплен к рельсовой системе и может перемещаться в x- и/или z-плоскостях. Угол наклона иглы можно регулировать с помощью колеса угла впрыска . (К, Л) Наконечник иглы (белый наконечник стрелки) выравнивается с ПЕРЕМЕННЫМ током, когда он кажется наиболее ярким в ультразвуке (L). (M) Ультразвуковое изображение, показывающее процесс инъекции, в котором наконечник иглы находится в переменном токе и хорошо выровнен (белый наконечник стрелки). Сокращения: А = Амнион; AC = амниотическая полость; ExC = экзоцеломная полость; EC = эктоплацентальный конус. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

29. Переместите стадию к следующему эмбриону и повторите шаги 7.22-7.26 для двух других эмбрионов, если они имеют подходящие размеры AC.
30. Поднимите ультразвуковой зонд и иглу из PBS с помощью микроманипулятора. Отверните иглу от оператора, чтобы избежать повреждений и травм.
31. С помощью щипцов направьте^1-й и^2-й эмбрионы обратно в брюшко самки, осторожно протолкнув их через резинку. Осторожно захватите ткань, прилегающую к^3-му эмбриону, и потяните матку к верхнему концу упругого разреза. Осторожно подтяните^{щипцами} 4-6-й эмбрионы и^{дайте 3-му} эмбриону вновь войти в брюшко.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен без изменения PBS или удаления чашки Петри.
32. Повторяйте по мере необходимости до тех пор, пока не будут введены все эмбрионы с оптимальными АК или не будет достигнут предел времени.
33. Осторожно протолкните эмбрионы / матку обратно в брюшко самки.
34. Аспирируйте PBS и удалите чашку Петри. Если вирус был использован, обрабатывайте как инфекционные отходы.
35. Сшить мышечный слой с помощью Vicryl (USP 6-0, длина иглы 13 мм, 3/8 круга) простыми непрерывными или прерванными швами и закрыть кожу 1-2 клипсами (см. Таблицу материалов).
36. Выключите насос изофлурана.
37. Снимите хирургическую ленту и поместите самку в положение лежа (живот вниз) в чистую клетку на нагревательной пластине с температурой 40 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что самка придет в сознание и станет подвижной в течение 10 минут. Убедитесь, что процедура завершена в течение 30 минут. Генетический фон, возраст и вес женщины могут влиять на чувствительность к анестезии. Следите за мышами во время операции на наличие признаков медленного дыхания (медленное дыхание означает, что анестезия слишком глубокая) или движения (анестезия слишком легкая). Бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг массы тела) или флуниксин (2,5 мг/кг) или аналогичный в соответствии с местными правилами защиты животных, может быть предоставлен через 8 часов после первой инъекции, если это необходимо.
38. Если будет введена инъекция другой женщине, подготовьте хирургическую область, наблюдая за пробуждением первой.
    1. Протрите хирургические инструменты 70% этанолом, чтобы удалить остатки крови или ткани и стерилизовать их в предварительно нагретом стеклянном стерилизаторе в течение 10 с. Выбросьте ватные тампоны и использованную папиросную бумагу. Вытрите чашку Петри и кусочки глины насухо папиросной бумагой.
39. Повторяйте шаги 7.1-7.35 до тех пор, пока не будут введены все женщины.
40. Опорожните и выбросьте иглу.
    1. Если в игле остался вирус или инъекционный раствор, нажмите Empty на наноинжекторе и опорожните содержимое иглы на папиросной бумаге.
    2. Полностью втяните металлический плунжер, нажимая Fill до тех пор, пока от контроллера не поступит двойной звуковой сигнал, который указывает на то, что плунжер полностью втянут.
    3. Ослабьте цангу и соскользните иглу с металлического плунжера. Выбросьте иглу в контейнер для отходов острых предметов.
41. Очистите скамейку BSL-2.
    1. Если был использован вирус, опрыскайте все хирургическое поле дезинфицирующим средством (см. Таблицу материалов). Через 15 мин протрите дезинфицирующее средство и очистите все хирургическое поле 70% этанолом. Если вирус не использовался, очистите все поверхности 70% этанолом.
    2. Протрите все оставшиеся PBS с ультразвукового зонда сухой, мягкой и безворсовой папиросной бумагой.
42. Выбрасывать отходы в соответствии с руководящими принципами биобезопасности.
43. Выключите ультразвуковой аппарат, нагревательный стол, стенд BSL2 и питание O₂ .

Результаты

Эмбрионы, введенные в E7.5 с лентивирусом hPGK-H2B-GFP^11,12, собирали при E13.5 и исследовали под флуоресцентным диссекционным микроскопом (рисунок 5A). Успешная трансдукция нервной пластинки приводит к эмбрионам с сильной экспрессией флуоресцентного репортера в мозге в основном и в других тканях, полученных из эктодермы, например, в коже (рисунок 5A, B). Инъекция чрезмерно большого объема (больше, чем рекомендуемые здесь объемы, например, ≥500 нЛ) увеличивает давление в переменном токе и может привести либо к полному рассасыванию (данные не показаны), либо к дефектам нервной трубки, таким как экзенцефалия (рисунок 5А). Успешные инъекции при Е7.5 приводят к равномерной трансдукции из переднего мозга в задний мозг (рисунок 5C-J).

Лентивирусные титры около 2 × 10¹⁰ инфекционных единиц (IFU) достигают более 95% таргетирования, в то время как титры ~ 1 × 10⁹ IFU достигают 15% эффективности таргетирования¹⁵. Кроме того, структуры, которые ранее было трудно нацелить с помощью электропорации, такие как сосудистое сплетение^17,18, также являются целевыми (рисунок 5 E,F). Эффективность трансдукции может быть изменена путем корректировки вирусного титра, доставляемого в AC. Инъекции низкого титра приводят к трансдукции одноклеточных клонов (рисунок 5C, рисунок 5E и рисунок 5G, H), в то время как использование вируса с высоким титром трансдуцирует почти 100% всего мозга (рисунок 5D, рисунок 5F, рисунок 5H и рисунок 5J ). Таким образом, NEPTUNE может быть использован либо для клональной трансдукции, отслеживания линий и генетического скрининга, либо для изучения глобальных эффектов гиперэкспрессии генов или понижения регуляции во всем мозге.

Развитие глаз млекопитающих является результатом хорошо организованной связи между тремя производными эмбриональной эктодермы: нервная сетчатка (NR) и пигментный эпителий сетчатки (RPE) получены из нейроэпителия вентрального переднего мозга, в то время как поверхностная эктодерма дает начало будущему хрусталику и эпителию роговицы. Однако центральная строма и задний эндотелий, два других слоя роговицы, получены из клеток нервного гребня периокулярной мезенхимы^19,20. Корональные срезы через эмбрионы E13.5, введенные в E7.5 с высокотитерным лентивирусом, показали, подобно мозгу, высокую и равномерную трансдукцию нервной ткани глаза, а также хрусталика, роговицы и мезенхимы (рисунок 5K). По мере прогрессирования нейруляции инъекции e8.5 и E9.5 приводят к продолжению нацеливания на хрусталик и эпителий роговицы (рисунок 5L и рисунок 5N), в то время как трансдукция тканей глаза, полученных из нейроэктодермы, менее эффективна при E8.5 (Рисунок 5L, M) или не нацелена на E9.5 (Рисунок 5N).

В то время как большинство вирусных частиц заражают открытые ткани при инъекции, некоторые частицы трансдуцируют неэктодермальные производные ткани, которые развиваются позже (рисунок 6A). Слюнные железы и протоки развиваются вокруг E11.5 из орального эпителия²¹ и нацелены на NEPTUNE (рисунок 6B). После инъекций при Е9.5 хорошо трансдуцируется лингвальный эпителий языка; однако лежащая в основе мезенхима отрицательна (рисунок 6C; скобки обозначают трансдуцированные клетки; звездочки обозначают автофлуоресцентный сигнал, а не трансдуцированные клетки). Кроме того, внутри лингвального эпителия имеются положительные кластеры, разделенные отрицательными участками (рисунок 6С, белые наконечники стрел), предполагающие трансдукцию поверхности сосочков. Нейронные гребневые клетки были описаны в нижележащей мезенхиме языка и в лингвальном эпителии, где они участвуют в развитии вкусовых сосочков и вкусовых рецепторов²². Действительно, инъекции E7.5 приводят к широко распространенной трансдукции мезенхимы языка в E13.5 (рисунок 6D), предполагая, что ранние инъекции нацелены на клетки нервного гребня, способствуя мезенхиме в языке.

У позвоночных дорсальные корневые ганглии (ДРГ) являются центральным компонентом периферической нервной системы (ПНС), так как весь соматосенсорный вход с периферии организма (температура, боль, давление) передается в мозг через активацию нейронов ДРГ²³. Как нейроны, так и глиальные клетки DRG получены из клеток²⁴ нервного гребня ствола. Инъекция лентивируса, при которой вездесущий промотор hPGK контролирует экспрессию флуоресцентного репортера, приводит к широкому нацеливанию на центральную и периферическую нервную систему (рисунок 7A), преобразуя как нейроны, так и предшественники в спинном мозге (рисунок 7B), а также DRG (рисунок 7C). Использование MiniPromoter для двойного кортина²⁵ позволяет ограничить экспрессию GFP только нейронами (¹⁵ и рисунок 7D,E).

Рисунок 5: Высокая эффективность или клональная трансдукция с neptune. (A) Эмбрионы E13.5 под рассеченным микроскопом, освещенным стандартным освещением (левая панель), и те же эмбрионы, освещенные для GFP (правая панель). Неинъектированный эмбрион слева, успешно введенный эмбрион справа, дающий положительный сигнал в мозг (самый правый эмбрион). Эксэнцефальный эмбрион из-за избыточного объема вводится (средний эмбрион). (B) Нацеливание на кожу и мозг с помощью инъекции E7.5. Шкала бар = 50 мкм. (C, D) E13.5 конфокальные изображения переднего мозга с низкой клональной трансдукцией (C) или высокоэффективной трансдукцией (D). (C, E, G, I) Клональная трансдукция различных областей мозга. (D, F, H, J) Высокоэффективная трансдукция различных областей мозга. Шкала стержней = 200 мкм. Различные эффективности трансдукции являются репрезентативными для других областей ЦНС. (Е, Ф) Сосудистое сплетение, направленное, клонально (E) или с высокой эффективностью (F). Шкала баров = 200 мкм. (G, H) Клональное нацеливание (G) и высокоэффективное (H) нацеливание на задний мозг, увеличенное в (I, J). Шкала баров = 200 мкм. (K) экспрессия репортера GFP в глазу при E13.5 после внутриутробной инъекции при E7.5 (L, M) GFP репортерная экспрессия в глазу при E15.5 после внутриутробной инъекции при E8.5 (L), коробчатая область увеличена в (M), или при E9.5 (N). Автофлуоресцентные кровеносные сосуды отмечены белыми звездами. Шкала стержней = 100 мкм. Сокращения: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; C = роговица; LE = эпителий хрусталика; LF = волокна линзы; M = Мезенхима; NR = нервная сетчатка; ON = зрительный нерв; RPE = пигментный эпителий сетчатки; GFP = зеленый флуоресцентный белок; ЦНС = центральная нервная система. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Внутриутробная трансдукция ненейронных тканей. (A) Конфокальное изображение полости рта E15.5. Эмбриону вводили флуоресцентный репортерный лентивирус на E9.5. Шкала бара = 200 мкм. (B, C) (B) Увеличение вставки панели; эпителий слюнных протоков, трансдуцированный вирусом. (C) Увеличение вставки панели; дорсальный лингвальный эпителий трансдуцирован вирусом-репортером GFP (белая скобка). Лежащая в основе мезенхима, полученная из клеток нервного гребня, отрицательна. Белые наконечники стрел обозначают сосочки с отрицательными клетками нервного гребня, окруженными трансдуцированными вирусом эпителиальными клетками (аутофлуоресцентные кровеносные клетки / сосуды отмечены белыми звездами). Шкала баров = 50 мкм. (D) Схематическое и конфокальное изображение мезенхимы языка E13.5 после инъекций флуоресцентного репортерного вируса на E7.5. Шкала бар = 50 мкм. Аббревиатуры: D = Дорсальный; M = Мезенхима; N = носоглотка; SLD = сублингвальный канал; SMD = подчелюстной канал; T = язык; V = Вентральный; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Трансдукция нейронных гребневых дорсальных корневых ганглиозных клеток. (A) Нептун, нацеленный на E7.5, позволяет нацеливаться как на ЦНС, так и на ПНС. (B) Конфокальное изображение спинного мозга E13.5 и DRG, введенных лентивирусом hPGK-H2B-GFP reporter на E7.5, показывает трансдукцию как нейронных предшественников SOX2⁺ , так и нейронов NeuN⁺ . Шкала = 100 мкм. (C) Коробочная область B, показывающая DRG с выражением GFP в популяциях клеток SOX2⁺ (белые стрелки) и NeuN⁺ (белые наконечники стрелок). Шкала бара = 20 мкм. (D) Конфокальное изображение E13.5 спинного мозга и DRG, вводимого лентивирусом DCX-H2B-GFP при E7.5, нацеленное только на клетки DCX⁺ . Шкала = 100 мкм. (E) Коробочная область D , показывающая DRG с экспрессией GFP, ограниченной нейронами DCX⁺ (белые наконечники стрелок). ^{DCX-ячейки} отрицательны для GFP (белые стрелки). Шкала бар = 20 мкм. Сокращения: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; ЦНС = центральная нервная система; ПНС = периферическая нервная система; DRG = дорсальные корневые ганглии; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

В этом протоколе есть несколько шагов, которые влияют на эмбриональную выживаемость, качество инъекций и показания. Гестационный возраст эмбрионов определяется как E0,5 в полдень в день вагинальной пробки после ночного спаривания. Выполнение ультразвуковой проверки на беременность при E6.5 в конце дня / вечером гарантирует, что эмбрионы достаточно развиты, чтобы быть идентифицированными ультразвуком. Проверка (1) позволяет предварительно проверить, сколько мышей на самом деле беременны, (2) гарантирует, что вирус не размораживается без необходимости и не тратится впустую в случае, если мыши с положительным результатом не беременны, и (3) уменьшает ненужные вмешательства на мышах (избегает операции на небеременных самках).

При E7.5 эмбрионы чувствительны к внешним силам и с ними следует обращаться осторожно. Например, натягивание на рога матки или сдавливание децидуаса может привести к рассасыванию эмбриона. Ткань матки всегда должна быть влажной, когда она находится за пределами женского живота, чтобы предотвратить высыхание ткани. Большая часть децидуа должна оставаться внутри женского живота, при этом только 3-4 подвергаются инъекциям. Острота иглы является еще одним важным фактором, определяющим успешные инъекции. Тупые или сломанные кончики игл приводят к повторному тыканию децидуа или сжатию в моделирующую глину перед входом в переменный ток, что может увеличить скорость рассасывания. Поэтому хорошо измельченные и острые иглы всегда следует безопасно хранить и заменять максимум после 2 самок.

Этот протокол описывает, как нацелиться на нейронную пластину с помощью одной единственной инъекции лентивируса. Кроме того, он показывает, как эффективность трансдукции может быть адаптирована от одноклеточных клонов ко всему мозгу. Тем не менее, другие ненейронные ткани, включая кожу и оральный эпителий, также являются мишенью. Кроме того, трансдуцируются все типы клеток (предшественники и дифференцированные клетки), что делает этот подход эффективным, но неспецифическим. Использование мини-промотеров в вирусной конструкции приводит к специфической экспрессии трансгена в нейронах или астроцитах¹⁵. Это имеет то преимущество, что позволяет избежать использования специализированных трансгенных животных Cre и, следовательно, снижает количество рабочей силы (поддержание штамма и генотипирование) и затраты.

К числу ограничений НЕПТУНА относятся его технические трудности, проблемы с получением беременных женщин с предсказуемой и последовательной скоростью, а также затраты на приобретение специализированных приборов. Кроме того, неселективное нацеливание на клетки лентивирусом можно рассматривать как преимущество и ограничение метода. Инъекция больших объемов в АС приводит к экзенцефалии¹³, хотя пороков развития мозга и экзоэнцефалии можно избежать с помощью объемов, описанных здесь¹⁵. Таким образом, негативное влияние на развитие мозга представляет собой риск с внутриутробными наноинъекциями, которых следует тщательно избегать, вводя правильные объемы, адаптированные к эмбриональной стадии и размеру AC.

Будущие адаптации техники могут быть сосредоточены на вирусном тропизме. Аденоассоциированные вирусы (AAV) имеют различные серотипы, которые, как было показано, надежно нацелены на различные типы клеток в ЦНС^17,26. Однако AAV не интегрируются в геном клетки-хозяина и, следовательно, могут быть потеряны в клетках с высокой скоростью деления. Хотя есть несколько способов повысить специфичность НЕПТУНА, трансгенные животные по-прежнему являются золотым стандартом, когда дело доходит до генных манипуляций in vivo. Мыши Cas9 и лентивирус, кодирующий sgRNA, использовались для генетического скрининга в эмбриональном эпидермисе²⁷ и также могут быть адаптированы к развивающейся ЦНС.

Инъекции в ПЕРЕМЕННЫЙ ток при Е7.5 эффективно нацелены на клетки нейроэктодермы до начала нейруляции и нацелены на развивающийся мозг более эффективно, чем при внутриутробной электропорации. Это позволяет изучать генетические сигналы, важные для развития мозга, с более раннего момента времени. В отличие от классических генетических моделей мышей, NEPTUNE предлагает гибкий подход к выполнению функционального анализа генов. Фенотипы после сверхэкспрессии или делеции генов могут быть изучены в течение нескольких дней или недель по сравнению с месяцами или годами. Инъекции нескольких вирусных конструкций позволяют манипулировать несколькими генами в пределах одного эмбриона и избежать порождения двойных или тройных нокаутирующих животных. Таким образом, NEPTUNE не только экономит время, но и может уменьшить количество животных, используемых в исследованиях.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD Bioscience	309628
27 G Needle	BD Bioscience	300635
3.5 inches capillaries	Drummond Scientific	3000203G/X	Were used to pull in house needles
70 MHz MS Series transducer	Visual Sonics	MS700
Aquasonic clear ultrasound gel	Parker Laboratories	Mar-50
Autoclip Applier 9 mm	Angthos	12020-09
CD1 mice	Charles River, Germany	Crl:CD1(ICR)	Females: from age of 8 weeks old Males: from the age of 12 weeks old
Cotton Swab	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
Dressing forceps delicate straight 13 cm	Agnthos	08-032-130
EG-400 Narishige Micropipette Grinder	Narishige	NA
EZ clips 9 mm	Angthos	59027	clips
Iris Scissors, Super Cut, straight, 9 cm	Agnthos	307-336-090
Isofluorane	Baxter Medical AB	EAN: 50085412586613	Purchased from Swedish Pharmacy
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
Membrane Tape	Visual Sonics	SA-11053
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Modeling Clay	Sense AB	10209
Mouse Handling Table	Visual Sonics	50249
Nanoject II Auto Injector Kit	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C
Petri dish with central opening (low wall)	Visual Sonics	SA-11620
Petri dish, (ØxH): 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont	130000132037	disinfectant
Silicone membrane	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, hot bead sterilizer	Angthos	31100
Surgical Tape (1.25 cm x 9.14 m)	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Anesthesia System	Visual Sonics	VS-12055
Vevo Imaging Station 2	Visual Sonics	VS-11983
Vevo2100	Visual Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0; C-3 needle, 45 cm purple filament	Agnthos	J384H