Изучение незаконного оборота мембранных белков в фоторецепторных клетках дрозофилы с использованием белков, помеченных eGFP

Резюме

Здесь описаны неинвазивные методы локализации белков фоторецепторной мембраны и оценки дегенерации сетчатки в глазу с помощью флуоресценции eGFP.

Аннотация

Мембранный промысел белка регулирует включение и удаление рецепторов и ионных каналов в плазматическую мембрану. Этот процесс принципиально важен для клеточной функции и клеточной целостности нейронов. Фоторецепторные клетки Drosophila стали моделью для изучения трафика мембранного белка. Помимо родопсина, который при освещении интернализуется из фоторецепторной мембраны и деградирует, ионный канал транзиторного рецепторного потенциала (TRPL) у дрозофилы демонстрирует светозависимую транслокацию между рабдомеральной фоторецепторной мембраной (где она расположена в темноте) и телом фоторецепторной клетки (в которую он транспортируется при освещении). Этот внутриклеточный транспорт TRPL может быть изучен простым и неинвазивным способом путем экспрессии TRPL с тегами eGFP в фоторецепторных клетках. Затем флуоресценцию eGFP можно наблюдать либо в глубоком псевдопупиле, либо с помощью микроскопии погружения в воду. Эти методы позволяют обнаруживать флуоресценцию в интактном глазу и поэтому полезны для высокопроизводительных анализов и генетических скринингов мутантов Drosophila , дефектных транслокации TRPL. Здесь подробно объясняются подготовка мух, микроскопические методы, а также методы количественной оценки, используемые для изучения этой световой транслокации TRPL. Эти методы могут быть применены также для исследований незаконного оборота других фоторецепторных белков Drosophila , например, родопсина. Кроме того, используя рэбдомеральные белки, помеченные eGFP, эти методы могут быть использованы для оценки дегенерации фоторецепторных клеток.

Введение

Доставляя и удаляя белки в плазматическую мембрану и из нее, мембранный белковый трафик в нейронах контролирует оборудование плазматической мембраны с рецепторами, а также ионными каналами и, как следствие, регулирует функцию нейронов. Неправильная регуляция или дефекты в торговле белком обычно оказывают пагубное воздействие на клетки и приводят к дегенерации нейронов. У людей это может вызвать нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и Паркинсона или пигментный ретинит¹. Фоторецепторы в составном глазу Drosophila melanogaster стали модельной системой in vivo для изучения мембранного трафика белк....

протокол

1. Общие соображения

1. Используйте запасы дрозофилы , экспрессирующие постоянно рабдомерно расположенный флуоресцентный белок для морфологического анализа (например, TRP::eGFP, eGFP::NINAC) и транслокационные белки для анализа относительно незаконного оборота белка (например, TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).
2. Предопределить условия освещенности отобранных мух для экспериментального подхода.
   1. Для темной адаптации держите мух в темных ящиках в течение желаемого периода при 25 °C. Для освещения до 16 ч в экспериментах по транслокации (например, TRPL::eGFP, экспрессирующих мухи), держите мух под люминесцентной трубкой при комнатн....

Результаты

Были сгенерированы трансгенные мухи Drosophila, экспрессирующие слитый белок TRPL::eGFP под контролем промотора родопсина 1. У этих мух TRPL::eGFP экспрессируется в фоторецепторных клетках R1-6 сложного глаза и отображает зависимую от освещения локализацию. Когда мухи содержатся в темноте, TRPL::eGFP.......

Обсуждение

Применимость флуоресцентных белков и простота скрининга с помощью DPP-визуализации и микроскопии погружения в воду сетчатки доказали свою успешность многими группами¹². Стратегии, аналогичные представленным здесь, использовались в нескольких генетических скринингах для ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188271
CO2 anaesthesia fly pad	Flystuff	59-172
Cold light lamp (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	Zeiss
Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2]	Osram	4050300518039
Laboratory pipette (20-200 µL)	Eppendorf
Object slide	Roth	0656.1
Petri dish (94 mm)	Greiner Bio-One	633102
Pipette tips (200 µL)	Labsolute	7695844
Plasticine (Blu-Tack)	Bostik	30811745
Stereo microscope (SMZ445)	Nikon
Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica