Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь описаны неинвазивные методы локализации белков фоторецепторной мембраны и оценки дегенерации сетчатки в глазу с помощью флуоресценции eGFP.

Аннотация

Мембранный промысел белка регулирует включение и удаление рецепторов и ионных каналов в плазматическую мембрану. Этот процесс принципиально важен для клеточной функции и клеточной целостности нейронов. Фоторецепторные клетки Drosophila стали моделью для изучения трафика мембранного белка. Помимо родопсина, который при освещении интернализуется из фоторецепторной мембраны и деградирует, ионный канал транзиторного рецепторного потенциала (TRPL) у дрозофилы демонстрирует светозависимую транслокацию между рабдомеральной фоторецепторной мембраной (где она расположена в темноте) и телом фоторецепторной клетки (в которую он транспортируется при освещении). Этот внутриклеточный транспорт TRPL может быть изучен простым и неинвазивным способом путем экспрессии TRPL с тегами eGFP в фоторецепторных клетках. Затем флуоресценцию eGFP можно наблюдать либо в глубоком псевдопупиле, либо с помощью микроскопии погружения в воду. Эти методы позволяют обнаруживать флуоресценцию в интактном глазу и поэтому полезны для высокопроизводительных анализов и генетических скринингов мутантов Drosophila , дефектных транслокации TRPL. Здесь подробно объясняются подготовка мух, микроскопические методы, а также методы количественной оценки, используемые для изучения этой световой транслокации TRPL. Эти методы могут быть применены также для исследований незаконного оборота других фоторецепторных белков Drosophila , например, родопсина. Кроме того, используя рэбдомеральные белки, помеченные eGFP, эти методы могут быть использованы для оценки дегенерации фоторецепторных клеток.

Введение

Доставляя и удаляя белки в плазматическую мембрану и из нее, мембранный белковый трафик в нейронах контролирует оборудование плазматической мембраны с рецепторами, а также ионными каналами и, как следствие, регулирует функцию нейронов. Неправильная регуляция или дефекты в торговле белком обычно оказывают пагубное воздействие на клетки и приводят к дегенерации нейронов. У людей это может вызвать нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и Паркинсона или пигментный ретинит1. Фоторецепторы в составном глазу Drosophila melanogaster стали модельной системой in vivo для изучения мембранного трафика белк....

протокол

1. Общие соображения

  1. Используйте запасы дрозофилы , экспрессирующие постоянно рабдомерно расположенный флуоресцентный белок для морфологического анализа (например, TRP::eGFP, eGFP::NINAC) и транслокационные белки для анализа относительно незаконного оборота белка (например, TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).
  2. Предопределить условия освещенности отобранных мух для экспериментального подхода.
    1. Для темной адаптации держите мух в темных ящиках в течение желаемого периода при 25 °C. Для освещения до 16 ч в экспериментах по транслокации (например, TRPL::eGFP, экспрессирующих мухи), держите мух под люминесцентной трубкой при комнатн....

Результаты

Были сгенерированы трансгенные мухи Drosophila, экспрессирующие слитый белок TRPL::eGFP под контролем промотора родопсина 1. У этих мух TRPL::eGFP экспрессируется в фоторецепторных клетках R1-6 сложного глаза и отображает зависимую от освещения локализацию. Когда мухи содержатся в темноте, TRPL::eGFP.......

Обсуждение

Применимость флуоресцентных белков и простота скрининга с помощью DPP-визуализации и микроскопии погружения в воду сетчатки доказали свою успешность многими группами12. Стратегии, аналогичные представленным здесь, использовались в нескольких генетических скринингах для ?.......

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить наших студентов-исследователей на протяжении многих лет. В частности, Нина Мейер, Сибилла Майер, Джулиана Каим и Лаура Джагги, чьи данные были использованы в этом протоколе в качестве репрезентативных результатов. Исследования нашей группы, представленные здесь, финансировались за счет грантов Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) Армину Хуберу.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL centrifuge tubeGreiner Bio-One188271
CO2 anaesthesia fly padFlystuff59-172
Cold light lamp (KL 1500 LCD)Zeiss
Fiji/ImageJNIH
Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)Zeiss
Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13)
[1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2]
and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2]
Osram4050300518039
Laboratory pipette (20-200 µL)Eppendorf
Object slideRoth0656.1
Petri dish (94 mm)Greiner Bio-One633102
Pipette tips (200 µL)Labsolute7695844
Plasticine (Blu-Tack)Bostik30811745
Stereo microscope (SMZ445)Nikon
Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)Leica

Ссылки

  1. Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).
  2. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. <....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

179

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены