Оценка здоровья митохондрий в связанных с раком фибробластах, выделенных из 3D-многоклеточных сфероидов опухоли легкого

Резюме

Многоклеточные 3D-сфероиды опухолей были получены с клетками аденокарциномы легких, фибробластами и моноцитами с последующим выделением связанных с раком фибробластов (CAF) из этих сфероидов. Изолированные CAF сравнивали с нормальными фибробластами для оценки здоровья митохондрий путем изучения митохондриального трансмембранного потенциала, активных форм кислорода и ферментативной активности.

Аннотация

Связанные с раком фибробласты (ЦАФ) являются одними из наиболее распространенных стромальных клеток, присутствующих в микроокружении опухоли, способствуя росту и прогрессированию опухоли. Сложность в микроокружении опухоли, включая секретом опухоли, низкосортное воспаление, гипоксию и окислительно-восстановительный дисбаланс, способствует гетеротипическому взаимодействию и позволяет трансформировать неактивные резидентные фибробласты, чтобы стать активными ЦАФ. CAF метаболически отличаются от нормальных фибробластов (NF), поскольку они более гликолитически активны, производят более высокие уровни активных форм реактивного кислорода (АФК) и чрезмерно экспрессируют экспортер лактата MCT-4, что приводит к открытию митохондриальной проницаемости переходной поры (MPTP). Здесь был описан метод анализа митохондриального здоровья активированных ЦАФ, выделенных из многоклеточных 3D-сфероидов опухоли, состоящих из клеток аденокарциномы легкого человека (A549), моноцитов человека (THP-1) и клеток фибробластов легких человека (MRC5). Сфероиды опухолей распадались через разные промежутки времени и посредством магнитно-активированной сортировки клеток выделяли ЦАФ. Митохондриальный мембранный потенциал ЦАФ оценивали с использованием красителя JC-1, продукции АФК путем окрашивания 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата (DCFDA) и активности ферментов в изолированных ЦАФ. Анализ митохондриального здоровья изолированных ЦАФ обеспечивает лучшее понимание обратного эффекта Варбурга, а также может быть применен для изучения последствий митохондриальных изменений CAF, таких как метаболические потоки и соответствующие регуляторные механизмы на гетерогенность рака легких. Таким образом, настоящее исследование выступает за понимание взаимодействия опухоли и стромы на здоровье митохондрий. Это обеспечит платформу для проверки кандидатов на митохондриальные препараты на их эффективность против ЦАФ в качестве потенциальных терапевтических средств в микроокружении опухоли, тем самым предотвращая участие CAF в прогрессировании рака легких.

Введение

Солидные опухоли состоят из гетерогенных клеточных популяций, которые руководствуются микроокружением опухоли (TME), однако происхождение большинства клеток еще предстоит открыть. В основном стромальные и иммунные клетки (фибробласты, эндотелиальные клетки, моноциты, макрофаги, дендритные клетки, В-клетки, Т-клетки и их подмножества) отражают гетерогенность опухоли при раке легких, молочной железы, почек и других солидных^{раковых} заболеваниях ^1,2,3. Понимание происхождения каждого подтипа и их трансдифференцировочного потенциала крайне необходимо для разработки передовых методов лечения этих видов рака. Анализ этой разнообразной клеточной популяции в биопсии человека представляет собой несколько проблем из-за типа опухоли, места, стадии, ограничения количества образца и специфических для пациента вариаций⁴. Таким образом, необходима экспериментальная модель, которая не только надежна, но и может имитировать состояние опухоли in vivo, зарекомендовав себя как идеальная для изучения перекрестных помех опухоль-строма и ее участия в патофизиологии заболевания.

Трехмерные (3D) многоклеточные опухолевые сфероидные (MCTS) культуры являются предпочтительной модельной системой опухолей in vitro из-за их сходства с природными аналогами. MCTS может лучше воспроизводить аспекты солидных опухолей, чем модели 2D-клеточных культур, включая их пространственную архитектуру, физиологические реакции, высвобождение растворимых медиаторов, паттерны экспрессии генов и механизмы лекарственной устойчивости. Более того, одним из основных преимуществ MCTS является то, что его можно использовать для изучения гетерогенности опухоли и микроокружения опухоли (TME). Метод подвешивания является наиболее часто используемым инструментом для разработки и анализа MCTS⁵. В этом методе различные клетки со средой суспендируются в виде капель, что позволяет их расти в согласованном 3D-агрегате и легко доступно для исследования. Техника проста; он не требует много клеток и устраняет потребность в специализированном субстрате, таком как агароза, для развития сфероидов⁶. Дополнительное преимущество данного метода заключается в воспроизводимости его методики. Кроме того, этот метод также использовался для совместной культивирования смешанных клеточных популяций, таких как эндотелиальные клетки и опухолевые клетки, для моделирования раннего^{опухолевого} ангиогенеза 7.

В этом исследовании многоклеточные 3D-сфероиды опухолей легких были получены с клетками аденокарциномы легких, фибробластами и моноцитами с использованием метода висячей капли, который имитирует микроокружение опухоли легких. Затем популяция связанных с раком фибробластов (CAF) была выделена для изучения здоровья митохондрий. Основная идея разработки этих сфероидов заключается в том, чтобы изолировать ЦАФ, поскольку перекрестные помехи между клетками в сфероидах могут преобразовать фибробласты в мио-фибробласт-подобное активированное состояние CAF. Во-вторых, это исследование может также показать, как аберрантная выработка АФК и митохондриальная дисфункция приводят нормальные фибробласты к более агрессивному фенотипу CAF. Было обнаружено, что фибробласты, собранные внутри сфероидов опухоли, приобрели миофибробластные характеристики с повышенной активностью АФК и индукцией экспрессии метаболических генов. Этот протокол подчеркивает важность микроокружения опухоли в активации CAF и может быть отличной моделью для генерации in vitro и изучения фенотипических характеристик CAF.

протокол

1. Клеточная культура

1. Культивирование клеточной линии аденокарциномы легких человека A549 и моноцитарной клеточной линии человека THP-1 в среде RPMI1640 с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина при 37 °C в увлажненной камере с 5% CO₂.
2. Культивирование клеток фибробластов легкого человека MRC-5 в среде DMEM дополняют 10% FBS и 1% раствором пенициллина-стрептомицина при 37 °C в увлажненной камере с 5% CO₂.

2. Получение многоклеточных сфероидов опухоли с использованием клеточной линии аденокарциномы легких A549, фибробластов MRC5 и моноцитов THP-1

ПРИМЕЧАНИЕ: Многоклеточные опухолевые и неопухолевые 3D-сфероиды были приготовлены с использованием метода висячей капли в чашке для культивирования клеток толщиной 90 мм. Подробное описание развития этих сфероидов приведено ниже. Все реагенты клеточной культуры, такие как полная среда, PBS и 0,25% раствор трипсина-ЭДТА, должны быть предварительно нагреты при 37 °C перед использованием, если не указано иное.

1. Приготовление клеточной суспензии
   1. Выращивайте адгезивные клетки A549 и MRC5 (5 x 10⁶ клеток каждая) в полной питательной среде DMEM (модифицированная орлиная среда Dulbecco [DMEM] + 10% фетальная бычья сыворотка [FBS] + 1% пенициллин-стрептомицин) в колбах T25 при 37 °C в увлажненной камере с 5% CO₂.
   2. Для клеток THP-1 выращивают клеточную суспензию (5 х 10⁶ клеток) в полной питательной среде (RPMI1640 + 10% FBS + 1% пенициллин-стрептомицин) в колбах T25. Для лучшего роста поместите колбы T25 при 37 °C в увлажненную камеру с 5% CO₂ в стоячем положении.
   3. Через 3 дня, при 80%-85% слиянии, промыть клетки A549 и MRC5 безальциевым и магниевым PBS (фосфатным буферным физиологическим раствором), добавив 1 мл PBS (25-30 °C) в каждую колбу в течение 1 мин и аспирируя ее.
   4. Собирают клетки A549 и MRC5 из колбы, инкубируя их с 500 мкл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в течение 5 мин при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO_2. Сразу после этого добавляют 4 мл полной питательной среды для инактивации трипсина.
   5. Соберите клеточную суспензию из колбы T25 в трубку объемом 15 мл и гранулируйте ее при 125 х г в течение 5 минут. Удалить надосадочный материал и повторно суспендировать клетки в 5 мл полной питательной среды.
2. Установление многоклеточных сфероидов опухолей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы образования сфероидов опухоли должны выполняться внутри кабинета биобезопасности для поддержания стерильных условий. Максимальный объем клеточной суспензии был стандартизирован как капля в 25 мкл, чтобы подготовить каплю таким образом, чтобы она не падала вниз при инвертировании крышек.
   1. Подсчитайте номера ячеек A549, MRC5 и THP-1 с помощью счетчика ячеек. Для каждой сфероидной капли (25 мкл) поддерживают следующие номера клеток: 5000 клеток A549, 4000 клеток MRC5 и 1000 клеток THP-1, следуя протоколу, описанному Arora et ^al.7. Рассчитайте номера ячеек соответствующим образом для объема 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды были первоначально приготовлены с тремя различными подсчетами клеток на сфероид (т.е. 5000, 8000 и 10 000). Кроме того, были проверены различные клеточные соотношения опухолевых клеток / фибробластов / моноцитов (1: 1: 1, 2: 2: 1, 4: 2: 1, 5: 2: 1 и 5: 4: 1). Наконец, успешное 3D-образование многоклеточных сфероидов было замечено с соотношением 5: 4: 1 и было использовано для исследования. Концентрацию фибробластов увеличивали исходя из его доли в микроокружении опухоли, что еще больше усиливало жесткость сфероидов опухоли. Подробная процедура была изложена в недавней публикации Arora et ^al.7.
   2. Готовят клеточную суспензию в соотношении 5 (A549, 2 x 10⁵ клеток/мл) к 4 (MRC5, 1,6 x 10⁵ клеток/мл) к 1 (THP-1, 5 x 10⁴ ячейки/мл) и составляют объем до 1 мл с полным DMEM.
   3. Поместите каплю 25 мкл клеточной суспензионной смеси на крышку 90-миллиметровой чашки для культивирования (примерно 50 капель/90 мм тарелки). Наполните дно 90-миллиметровой чашки стерильной водой объемом 10 мл.
   4. Осторожно переверните крышку над заполненной водой гидратационной камерой и поместите блюдо в инкубатор клеточной культуры на 3 дня.
   5. Контролируйте сфероиды под микроскопом при 10-кратном увеличении на 4-й день. Для получения изображений включите выключатель питания, аккуратно поместите 60-миллиметровую тарелку на сцену и выберите увеличение (10x). Отрегулируйте линзы и исследуйте клетки, чтобы проанализировать агрегацию и пролиферацию клеток. Нажмите кнопки «Заморозить» и «Сохранить», установленные на микроскопе, чтобы захватить изображение.
   6. Измените питательную среду на 4-й день, тщательно аспирируя 20 мкл среды из каждой капли и заменяя ее свежей полной питательной средой.

3. Живо-мертвый анализ сфероидов опухолей

1. На 7 и 10 день осторожно переверните 90-миллиметровую тарелку в шкафу биобезопасности и используйте пипетку объемом 200 мкл для сбора сфероидов из каждой капли. Соберите по пять сфероидов каждый в трубку объемом 1,5 мл.
2. Добавьте 500 мкл 1x PBS в 1,5 мл трубку, содержащую сфероиды и центрифугу при 125 х г в течение 5 мин. Осторожно отбросьте супернатант и повторно суспендируйте сфероиды в 200 мкл 1x PBS. Не пипетку строго, чтобы избежать распада сфероидов.
3. Выделите сфероиды с помощью пипетки объемом 200 мкл на 60-миллиметровой тарелке для окрашивания кальциеном-АМ и йодистым пропидием.
4. Насадите на сфероиды 5 мкл раствора кальциина-АМ 1 мкМ и 5 мкл раствора пропидидия йодида 2 мг/мл. Инкубировать в течение 10 мин. После завершения инкубационного периода промыть сфероиды аккуратно 1x PBS дважды.
5. Поместите 60-миллиметровую тарелку, содержащую сфероиды, под флуоресцентный инвертированный микроскоп, наблюдайте и захватывайте изображения с 10-кратным увеличением, выбрав опцию флуоресценции в программном обеспечении микроскопа и выбрав FITC (зеленый флуоресцентный канал; возбуждение 490 нм, излучение 515 нм) для кальцеина и техасского красного канала (TXR; возбуждение 535 нм, излучение 617 нм).
   1. Для получения изображения включите Ctr Adv, который является переключателем 1, с последующим включением процессора. Дождитесь загрузки программной системы. После загрузки аккуратно поместите 60-миллиметровую тарелку на сцену и выберите увеличительный (10x) и флуоресцентный каналы (FITC, TXR). Отрегулируйте объективы и выполните сканирование изображения.
   2. Чтобы просмотреть изображение в системе, выберите опцию Live и просмотрите изображение. Отрегулируйте интенсивность флуоресценции для соответствующей оптимизации. Сохраните изображение, нажав кнопку Сохранить .
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе сфероиды будут видны невооруженным глазом. Под световым микроскопом сфероиды будут выглядеть как круглые, жесткие сферы при 10-кратном увеличении. Несколько сфероидов могут быть собраны одновременно с помощью пипетки 200 мкл.

4. Распад и клеточная суспензия опухолевых сфероидов

1. Соберите 200 сфероидов опухоли каждый на 7 и 10 день, используя пипетку 1 мл в трубке 15 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сбором тщательно проверьте форму и форму одного сфероида после переноса его на микроскопический слайд или на 30-миллиметровую тарелку и наблюдайте под микроскопом.
2. Гранулируют сфероиды центрифугированием при 125 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант осторожно, не нарушая сфероиды опухоли.
3. Тщательно промыть сфероиды 200 мкл PBS, центрифугу при 125 х г в течение 5 мин и осторожно выбросить надосадочный материал.
4. Для распада сфероидов добавляют 400 мкл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и держат при 37 °C в течение 10 мин. Выполняют энергичное пипетирование для полного распада сфероидов.
5. Нейтрализуют трипсин, добавляя 1 мл полной питательной среды DMEM. Центрифугу при 125 х г в течение 5 мин и осторожно выбросьте супернатант.
6. Повторно суспендируют гранулу в 1 мл полной среды DMEM и подсчитают общее количество клеток.

5. Выделение связанных с раком фибробластов (CAF) через микрошарики

1. Для выделения ЦАФ из сфероидов опухоли повторно суспендируют 1 х 10⁷ клеток в 80 мкл буфера холодной магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) (PBS при рН 7,2, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина [BSA] и 2 мМ этилендиамина тетрауксусной кислоты [ЭДТА]).
2. Инкубируют клеточную суспензию (содержащую 1 х 10⁷ клеток) с 20 мкл антифибробластных микрошариков. Хорошо перемешать, аккуратно постукивая по тюбику, и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Промыть клетки 1 мл холодного буфера MACS, центрифугу при 125 х г в течение 5 мин и аспирировать супернатант. Повторное суспендирование клеток в 500 мкл буфера MACS.
4. Для разделения клеток на магнитной основе шариков подготовьте колонну MACS, промыв ее 3 мл буфера MACS.
5. Поместите клеточную суспензию в столбец, а затем в проточную коллекцию, содержащую немаркированную клеточную популяцию.
6. Трижды промойте колонку 3 мл буфера MACS. Снимите колонну с сепаратора и поместите ее на трубку для сбора.
7. Соберите клетки, меченые микрогранулами антифибробластов, добавив 5 мл буфера MACS и прочно протолкнув плунжер в колонну.
8. Центрифугируйте меченые ячейки при 125 х г в течение 5 мин. Продолжайте использовать изолированные фибробласты для последующих применений.

6. Анализ экспрессии ACTA2 на основе проточной цитометрии в изолированных КАФ

1. Подсчитайте количество изолированных CAF и используйте приблизительно 6 x 10⁴ ячейки. Вымойте ячейки один раз с PBS, центрифугируйте при 125 х г в течение 5 мин и аспирируйте супернатант.
2. Добавьте 100 мкл буфера пермеабилизации клеток (PBS + 0,5% BSA + 0,3% v/v Triton X-100) и инкубируйте клетки при 4 °C в течение 30 мин.
3. Периодически вращайте клетки, чтобы поддерживать одноклеточную суспензию. Центрифуга и повторное суспендирование клеток в 100 мкл буфера пермеабилизации клеток.
4. Добавьте 2 мкл конъюгированного античеловеческого антитела к α-СМА и инкубируйте при 4 °C в течение 45 мин. После инкубации добавляют 1 мл пермеабилизационного буфера и центрифугу при 125 х г в течение 5 мин для удаления избытка антител.
5. Повторное суспендирование гранулы в 400 мкл буфера пермеабилизации для проточного цитометрического анализа. Соберите в общей сложности 10 000 событий каждого образца в проточном цитометре. Выберите положительные клетки ACTA2 после различения популяций клеток на основе их прямого и бокового рассеяния, выбрав популяцию синглета с последующим выбором положительных клеток ACTA2 , которые отображаются как один пик на гистограмме с одним параметром.

7. Окрашивание JC-1 для определения мембранного потенциала митохондрий

1. Подсчитайте количество выделенных КЭФ и используйте приблизительно 6 х 10⁴ клеток для окрашивания 5,5,6,6'-тетрахлор-1,1',3,3' тетраэтилбензими-дазоилкарбоцианин йодида (JC-1) с помощью проточной цитометрии.
2. Тщательно промыть клетки PBS, центрифугировать при 125 х г в течение 5 мин, аспирировать супернатант и добавить 100 мкл буфера окрашивания клеток.
3. Добавляют краситель JC-1 в рабочей концентрации 2 мкМ и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. По окончании инкубации промыть клетки ПБС, центрифугировать при 125 х г в течение 5 мин и повторно суспендировать в конечном объеме 400 мкл.
4. Получите в общей сложности 20 000 событий каждого образца в проточном цитометре. Количественное определение потенциала митохондриальной мембраны путем измерения агрегатов JC-1 с красным смещением на канале FL-2 и мономеров с зеленым смещением на канале FL-1.

8. Окрашивание DCFDA для оценки уровней клеточных активных форм кислорода (АФК)

1. Используйте целые сфероиды (50 чисел), а также изолированные CAF (6 x 10⁴ клетки) из сфероидов для окрашивания диацетатом 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина (DCFDA).
2. Тщательно промыть клетки PBS, центрифугировать при 125 х г в течение 5 мин, аспирировать супернатант и добавить 100 мкл буфера окрашивания клеток.
3. Добавляют краситель DCFDA в рабочей концентрации 1 мкМ и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Дважды промыть клетки PBS, центрифугу при 125 х г в течение 5 мин, а затем повторно суспендировать в конечном объеме 400 мкл.
4. Получите в общей сложности 20 000 событий каждого образца в проточном цитометре. Оцените уровни АФК, измерив флуоресценцию на 7-й и 10-й день для сфероидов, а также изолированных КАФ.

9. RT-qPCR анализ маркеров CAF и гликолитических генов

1. Извлеките РНК из отсортированных CAF с помощью одноклеточного лизисного набора в соответствии с протоколом производителя. Подготовьте кДНК из 100 нг РНК с помощью набора для синтеза кДНК в соответствии с рекомендациями производителя.
2. Выполняют RT-qPCR для анализа относительной экспрессии маркеров CAF (ACTA2⁸ и COL1A2⁹) и гликолитического гена (GLUT1¹⁰ и MCT4¹¹). Выполните анализ кривой расплава после окончательного расширения, чтобы убедиться в специфичности продуктов. Нормализуйте данные, используя экспрессию GAPDH в качестве эталонного гена. Последовательности праймеров, используемые для RT-qPCR, перечислены в дополнительной таблице 1.

10. Экстракция и количественная оценка клеточного белка из ЦАФ

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все этапы экстракции белка на льду, чтобы избежать деградации белка.

1. Повторно суспендировать приблизительно 4 х 10⁶ клеток CAF в 100 мкл ледяного буфера лизиса RIPA (содержащего 30 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS и 0,5% дезоксихолата натрия с 5 мМ коктейля протеазы Halt и ингибитора фосфатазы и 5 мМ ЭДТА при рН 7,4).
2. Строгий вихрь для правильного лизиса клеток. Обработайте ультразвуком суспензию ячейки на частоте 20 Гц, амплитуде 20% в течение 15 с и 3x импульсе.
3. После обработки ультразвуком центрифугируют белковый экстракт при 13 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Переложите супернатант в предварительно охлажденную трубку объемом 1,5 мл. Выполните анализ белка BCA для количественной оценки белка.

11. Спектрофотометрический анализ ферментативной активности в ЦАФ

ПРИМЕЧАНИЕ: В ЦАФах, полученных из сфероидов опухолей, анализируются следующие ферментные активности.

1. Измерение активности сукцинатдегидрогеназы
   1. Для оценки активности сукцинатдегидрогеназы (SDH) в КАФ получают SHE-буфер с 250 мМ сахарозы, 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислотой (HEPES) и 1 мМ этиленгликол-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (ЭГТА) и регулируют рН до 7,3. Добавить 0,4 мМ феназина метосульфата (ПМС), 0,2 мМ 2,6-дихлориндофенола (DCPIP), 50 мМ MgCl₂, 0,02% тритона X-100 и 1 мМ цианида в буфер SHE и сохранить при 37 °C.
   2. Извлеките клеточный белок из CAF, как описано на этапе 10 (2 x 10⁶ клеток). В каждой лунке из 96-луночной пластины инкубируют 100 мкл 0,1 мг клеточного белка со 100 мкл реакционной смеси SHE при 37 °C в течение 15 мин.
   3. Чтобы начать ферментативную активность, добавляют 10 мМ сукцината¹². Рассчитать активность фермента в нМ/мин/мл путем измерения изменений абсорбции при 600 нм.
   4. Коэффициент пересчета для DCIP составляет 0,0215 A/nM на основе коэффициента молярного вымирания¹². Рассчитайте относительную активность SDH, используя указанную формулу:
      Относительная активность (нМ/мин/мл/фермент) = X X V
      Где ΔA/min = скорость ферментативной реакции (A_{начальная} - A_{конечная})/(_{время конечная} - A/min_{начальная}), Ve = объем образца, а V = объем реакции.
2. Оценка активности цитохром-с-оксидазы
   1. Чтобы оценить активность цитохром-с-оксидазы (ЦОГ) в КЭФ, добавляют 0,2 мг/мл клеточного белка в реакционный буферный раствор КМЭ, содержащий буфер KME (125 мМ KCl, 20 мМ 3-(N-морфолино)пропановую сульфоновую кислоту [MOPS] и 1 мМ EGTA, рН 7,4), 0,02 % тритона X-100 и 5 мМ аскорбата натрия.
   2. В отдельной пробирке смешать 50 мкМ цитохрома с цинохромом сердца лошади с 5 мМ аскорбата натрия и инкубировать при 37 °C в течение 5 мин¹³. После инкубации добавляют 20 мкл восстановленного цитохрома c к 500 мкл реакционного буферного раствора KME, содержащего клеточный белок.
   3. Рассчитать активность фермента в единицах/мкл путем измерения изменений абсорбции при 550 нм. Абсорбция цитохрома c при 550 нм изменяется со степенью его окисления. Разница в коэффициентах вымирания (мМ) между восстановленным и окисленным цитохромом c составляет 21,84 при 550 нм¹⁴. Рассчитайте величину активности фермента в клеточном лизате как:
      Единицы измерения/мкл =
      Где ΔA/min = A/min_проба - A/min_пустой и 21,84 = Δԑ^mM между окисленным цитохромом c и восстановленным цитохромом c при 550 нм
3. Оценка активности лактатдегидрогеназы
   1. Выполните анализ лактатдегидрогеназы (ЛДГ) с использованием набора для анализа клеток лактатдегидрогеназы в соответствии с инструкциями производителя.
   2. Добавьте тестовый реагент LDH (10 мкл) к 0,5 мг/мл клеточных белков и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C. По окончании инкубации измеряют абсорбцию при 45 нм каждые 1 мин в течение 8 мин.
   3. Подготовьте стандарты NADH для колориметрического обнаружения с использованием 0 (пустой), 2,5, 5, 7,5, 10 и 12,5 нМ/лунка NADH с последующим добавлением тестового реагента LDH к конечному объему 50 мкл.
   4. Постройте различия в поглощении между_{T начальным} и_{T-конечным} на стандартной кривой NADH для определения величины генерации NADH. Оцените активность ЛДГ, используя указанную формулу:
      Активность ЛДГ = X коэффициент разбавления пробы
      Где B = количество (nmole) NADH, генерируемое между T_{начальным} и_{T-конечным}, время реакции = T_final - T_{начальное} (min), а Ve = объем образца (mL), добавленный к скважине.

Результаты

На рисунке 1 показано развитие многоклеточных сфероидов опухоли с использованием трех различных клеточных популяций - A549 (аденокарцинома легких), MRC-5 (фибробласты) и THP-1 (моноциты) - методом висячей капли, как это наблюдалось на 7-й и 10-й день под микроскопом. На 7-й день сфер?...

Обсуждение

Настоящее исследование вводит развитие многоклеточных сфероидов опухоли, включающих опухолевые клетки, популяцию стромальных клеток (т.е. фибробласты) и популяцию иммунных клеток (т.е. моноциты) с использованием модифицированного метода висячих капель. Фибробласты и моноциты / макроф?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
APC anti-human α-SMA	R&D systems	Cat# IC1420A
Anti-fibroblast microbeads	Miltenyi Biotec	Cat# 130-050-601
Cell lines
A549 lung adenocarcinoma cells	NCCS Pune	-
MRC-5 fetal lung fibroblasts	ATCC	CCL-171
THP-1 Human monocytes	NCCS Pune	-
Chemicals
BSA	Himedia	Cat# 9048-46-8
2,6-dichloroindophenol (DCPIP)	SRL	Cat# 55287
Calcein-AM	Thermo Fisher Scientific	Cat# C3099
DAPI	Thermo Fisher Scientific	Cat# D1306
DCFDA	Sigma	Cat# D6883
DMEM	Gibco	Cat# 11995073
DPBS	Gibco	Cat# 14190-144
EDTA	Thermo fisher scientific	Cat# 17892
EGTA	SRL	Cat# 62858
EZcoun Lactate Dehydrogenase Cell Assay Kit	HiMedia	Cat# CCK036
FBS	Gibco	Cat# 10082147
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 87786
HEPES	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15630080
Horse heart Cytochrome c	SRL	Cat# 81551
Image-iT Red hypoxia reagent	Thermo Fisher Scientific	Cat# H10498
JC-1 Dye	Thermo Fisher Scientific	Cat# T3168
KCl	Merck	Cat# P9541
MgCl2	Merck	Cat# M8266
MOPS	Thermo Fisher Scientific	Cat# 69824
Nacl	Sigma-Aldrich	Cat# S9888
NADH MB Grade	SRL	Cat# 54941
NP-40	Thermo Fisher Scientific	Cat# 85124
Penicillin/Streptomycin	Gibco	Cat# 15140122
Phenazine methosulfate (PMS)	SRL	Cat# 55782
Propidium iodide	Thermo fisher scientific	Cat# P1304MP
RPMI 1640	Gibco	Cat# 11875093
Single Cell Lysis Kit	Thermo Fisher Scientific	Cat# 4458235
Sodium ascorbate	Merck	Cat# A7631
Sodium cyanide	Sigma	Cat# 205222
Sodium Deoxycholate	Thermo Fisher Scientific	Cat# 89904
Sodium dodecyl sulphate	Sigma-Aldrich	Cat# L3771
Sodium succinate hexahydrate	SRL	Cat# 36313
Sucrose	Sigma	Cat# S0389
SuperScript VILO cDNA synthesis kit	Thermo Fisher Scientific	Cat# 11754-050
Triton X-100	Sigma	Cat# T8787
Trypsin 0.25% EDTA	Gibco	Cat# 25200072
Universal SYBR Green Supermix	BIO-RAD	Cat# 172-5124
Plasticware
MACS LS Columns	Miltenyi Biotec	Cat# 130-042-401
Equipment
Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	Cat# AMQAF1000
EVOS XL core imaging system	Thermo Fisher Scientific	Serial Number F0518-1727-0191
LAS X software	Leica Microsystems
Leica fluorescent inverted microscope	s	DMi8 automated S/N 424150)
Midi MACS separator	Miltenyi Biotec	Cat# 130-042-302