JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Используя модель мышей с неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП), вызванной диетой, мы описали использование новых методов микрокомпьютерной томографии in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП, уделяя особое внимание сосудистой сети печени из-за ее значительного участия в дисрегуляции печени, связанной с НАЖБП.

Аннотация

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является растущей глобальной проблемой здравоохранения, и воздействие НАЖБП усугубляется отсутствием эффективных методов лечения. Существенными ограничивающими факторами, препятствующими своевременной и точной диагностике (включая классификацию) и мониторингу НАЖБП, а также разработке потенциальных методов лечения, являются существующие недостатки в характеристике структуры микроокружения печени и оценке стадии заболевания пространственно-временным и неинвазивным способом. Используя модель мышей с НАЖБП, индуцированной диетой, мы исследовали использование методов микрокомпьютерной томографии (КТ) in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП, уделяя особое внимание сосудистой сети печени из-за ее значительного участия в дисрегуляции печени, связанной с НАЖБП. Эта методика визуализации позволяет проводить лонгитюдный анализ стеатоза печени и функционального поглощения тканей, а также оценивать относительный объем крови, диаметр воротной вены и плотность сосудистой сети. Понимание адаптации сосудистой сети печени во время прогрессирования НАЖБП и соотнесение этого с другими способами характеристики прогрессирования заболевания (стеатоз, воспаление, фиброз) с использованием предложенного метода может проложить путь к созданию новых, более эффективных и воспроизводимых подходов к исследованию НАЖБП на мышах. Ожидается, что этот протокол также повысит ценность доклинических моделей на животных для исследования разработки новых методов лечения прогрессирования заболевания.

Введение

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) — это метаболическое заболевание, которое поражает примерно 25% населения и >80% людей с морбидныможирением1. По оценкам, у одной трети этих людей прогрессирует неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), который характеризуется стеатозом печени, воспалением и фиброзом2. НАСГ – стадия заболевания со значительно более высоким риском развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК)3,4. По этой причине НАСГ в настоящее время является второй наиболее распространенной причиной трансплантации печени, и ожидается, что в скором времени он также станет наиболее важным предиктором трансплантации печени 5,6,7. Несмотря на распространенность и тяжесть заболевания, для НАЖБП не существует специфической терапии, а существующие методы лечения направлены только на борьбу с ассоциированными с заболеванием патологиями, такими как резистентность к инсулину и гиперлипидемия 5,6.

В последние годы патофизиологическая роль и адаптации эндотелия и, в целом, сосудистой сети метаболических тканей, таких как жировая ткань и печень, приобретают все большее значение в исследованиях, особенно при ожирении и метаболической дисрегуляции 7,8. Эндотелий представляет собой клеточный монослой, который выстилает сосудистую сеть изнутри, действуя как функциональный и структурный барьер. Он также способствует различным физиологическим и патологическим процессам, таким как тромбоз, транспорт метаболитов, воспаление и ангиогенез 9,10. В случае печени сосудистая сеть, среди прочих особенностей, характеризуется наличием высокоспециализированных клеток, определяемых как синусоидальные эндотелиальные клетки печени (ЛСЕК). Эти клетки не имеют базальной мембраны и имеют несколько фенестр, что облегчает перенос субстратов между кровью и паренхимой печени. Благодаря своему уникальному анатомическому расположению и характеристикам, LSEC, вероятно, играют решающую роль в патофизиологических процессах печени, включая развитие воспаления и фиброза печени во время НАЖБП/НАСГ. Действительно, патологические, молекулярные и клеточные адаптации, которые ЛСЕК претерпевают в ходе НАЖБП, способствуют прогрессированиюзаболевания11. В частности, LSEC-зависимый печеночный ангиогенез, происходящий во время НАЖБП, в значительной степени связан с развитием воспаления и прогрессированием заболевания до НАСГ или даже ГЦК12. Кроме того, ранняя НАЖБП, связанная с ожирением, характеризуется развитием инсулинорезистентности в ЛЖБП, что предшествует развитию воспаления печени или других распространенных признаков НАЖБП13.

Кроме того, в последнее время LSEC стали центральными регуляторами печеночного кровотока и адаптации сосудистой сети при заболеваниях печени различной этиологии14,15. Действительно, хроническое заболевание печени характеризуется выраженной внутрипеченочной вазоконстрикцией и повышенным сопротивлением кровотоку, что способствует развитию портальной гипертензии16. В случае с НАЖБП этому явлению способствуют несколько механизмов, связанных с LSEC. Например, инсулинорезистентность, специфичная для LSEC, как упоминалось выше, связана со снижением инсулинозависимой вазодилатации сосудистой сети печени13. Кроме того, в течение заболевания сосудистая сеть печени становится более чувствительной к сосудосуживающим средствам, что в дальнейшем способствует нарушению печеночного кровотока и приводит к возникновению сдвигового напряжения, что приводит к нарушению синусоидальной микроциркуляции17. Эти факты свидетельствуют о том, что сосудистая сеть является ключевой мишенью при заболеваниях печени. Тем не менее, ограничивающими факторами, препятствующими своевременной диагностике и мониторингу НАЖБП/НАСГ, а также разработке потенциальных методов лечения, являются недостатки в последовательной характеристике микроокружения печени и (микро)сосудистой структуры, а также в оценке стадии заболевания пространственно-временным и неинвазивным способом.

Микрокомпьютерная томография (КТ) в настоящее время является золотым стандартом неинвазивного метода визуализации для точного отображения анатомической информации в живом организме. Микро-КТ и МРТ представляют собой два взаимодополняющих метода визуализации, которые могут охватить широкий спектр патологий и обеспечить исключительное разрешение и детализацию визуализируемых структур и тканей. Микро-КТ, в частности, является очень быстрым и точным инструментом, который часто используется для изучения таких патологий, как заболевания костей и связанные с ними изменения костной поверхности18, оценки прогрессирования фиброза легких с течением времени19, диагностики рака легких и его стадии20 или даже исследования стоматологических патологий21 без какой-либо специальной подготовки (или разрушения) визуализируемых образцов.

Технология визуализации микро-КТ основана на различных свойствах затухания различных органов с точки зрения взаимодействия рентгеновских лучей с веществом. Органы с высокими различиями в ослаблении рентгеновского излучения изображаются на КТ-изображениях с высокой контрастностью (т.е. легкие кажутся темными, а кости светлыми). Органы, обладающие очень похожими свойствами ослабления (разные мягкие ткани), трудно различимы на КТ-изображениях22. Чтобы устранить это ограничение, специализированные контрастные вещества на основе йода, золота и висмута были широко исследованы для использования in vivo . Эти агенты изменяют свойства ослабления тканей, в которых они накапливаются, медленно выводятся из кровообращения и обеспечивают равномерное и стабильное помутнение всей сосудистой системы или выбранных тканей23.

В диагностике человека для определения содержания жира в печени уже используются компьютерная томография и аналогичные методы, такие как МРТ-измерение протонной плотности жировой фракции24,25. В контексте НАЖБП высокий контраст мягких тканей необходим для точного различения патологических поражений или мелких сосудов. Для этого используются контрастные вещества, обеспечивающие повышенное контрастирование характеристик печеночной ткани. Такие инструменты и материалы позволяют изучать множественные характеристики печени и возможные проявления патологии, такие как архитектура и плотность сосудистой сети, отложение липидов/стеатоз и функциональный захват тканей/перенос липидов (хиломикрон) в печени. Кроме того, можно оценить относительный объем крови в печени и диаметр воротной вены. За очень короткое время сканирования все эти параметры предоставляют различную и дополняющую информацию об оценке и прогрессировании НАЖБП, которая может быть использована для разработки неинвазивной и детальной диагностики.

В данной статье мы приводим пошаговый протокол использования новых методов микро-КТ визуализации in vivo в качестве неинвазивного метода оценки стадий прогрессирования НАЖБП. Используя этот протокол, можно провести продольный анализ стеатоза печени и функционального поглощения тканей, а также оценить относительный объем крови, диаметр воротной вены и плотность сосудистой сети, которые могут быть применены на мышиных моделях заболеваний печени.

протокол

Все процедуры были проведены персоналом BIOEMTECH в соответствии с европейскими и национальными нормами благосостояния и были одобрены национальными органами (номер лицензии EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Все эксперименты были спланированы и представлены в соответствии с руководящими принципами ПРИБК26. Мыши были приобретены в Греческом институте Пастера, Афины, Греция.

ПРИМЕЧАНИЕ: Животные содержались в индивидуально вентилируемых клетках, обогащенных рельсами и картонными тубами, в помещении при температуре 20-22 °C, относительной влажности 50%-60% и 12-часовом цикле свет/темнота (свет 07:00-19:00). Комбинация диеты с высоким содержанием жиров (HFD) и кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы (HFCS), фруктозо- и глюкозосодержащего подсластителя, широко используемого в современных типах диет, обогащенных жирами, была использована для индуцирования НАЖБП в качестве признанной надежной модели27,28,29,30. В возрасте 7-8 недель самцам мышей C57BL/6 предоставляли свободный доступ либо к нормальной диете (n = 2) с 10% килокалорий из жира, либо к HFD (n = 2), содержащей 60% килокалорий из жира с добавлением 5% HFCS в воде в течение 22 недель. Масса тела измерялась еженедельно с помощью цифровых весов, а в течение экспериментального периода за благополучием животных следили через день с помощью оценочного листа. В конце протокола визуализации мышей усыпили путем вывиха шейки матки.

1. Подготовка животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол визуализации представлен на рисунке 1.

  1. Обезболивайте мышь 3%-4% изофлураном (в комнатном воздухе) и поддерживайте температуру ее тела с помощью специальной грелки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие рефлекса отведения педали должно быть использовано для подтверждения достаточной глубины анестезии перед началом сканирования.
  2. Наносите офтальмологическую мазь на глаза животного перед экспериментами.
  3. Поместите животное в люльку компьютерного томографа, закрепите носовой конус и перейдите на 1,5%-3% изофлуран (в комнатном воздухе) для обслуживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие рефлекса отведения педали должно быть использовано для подтверждения соответствующего процентного содержания изофлурана для поддержания анестезии.
  4. Постоянно следите за мышью.

2. Предварительная подготовка к сканированию

ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация проводится в два экспериментальных этапа, чтобы позволить первому контрастному веществу быть надлежащим образом выведено из кровообращения и тканей. На первом этапе вводится eXIA (первое контрастное вещество), а на втором — ExiTron (второе контрастное вещество), как описано в разделе «Рабочий процесс визуализации» (раздел 3) ниже.

  1. Дайте контрастному веществу (eXIA или ExiTron, в зависимости от фазы эксперимента) нагреться до комнатной температуры в течение 3 часов.
  2. Установите следующие параметры сканирования на компьютерном томографе: протокол высокого разрешения при напряжении лампы 50 кВ и токе 460 мкА, неспиральный, 720 проекций/оборотов, четыре оборота и время сбора данных 4 минуты.

3. Рабочий процесс визуализации

  1. Экспериментальная фаза 1
    1. Рассчитайте и приготовьте объем первого вводимого контрастного вещества в неразбавленной дозе 6 мкл/г массы тела для максимального контрастирования.
    2. Подготовьте катетер для хвостовой вены, наполнив его физиологическим раствором и подключив к шприцу, наполненному контрастным веществом.
    3. Сделайте предварительное контрастное сканирование всего тела (WB) и печени.
    4. Убедитесь, что в шприце или катетере нет пузырьков или засоров.
    5. Введите предварительно заполненный катетер в хвостовую вену и введите контрастное вещество с помощью инъекции, выполняемой медленно и вручную, продолжительностью 1-3 минуты (не в виде болюсной инъекции). Шприцевой насос можно использовать, если он настроен на соответствующую скорость инфузии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хвост животного можно поместить в теплую воду, чтобы вызвать расширение сосудов и помочь с введением катетера
    6. Проводите сканирование ББ и печени в разные моменты времени, как указано в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если получение всех точек невозможно, основное внимание следует уделять 45-минутному периоду после инъекции (PI), который является точкой максимального поглощения печенью, и 48-часовому PI, когда достигается клиренс.
  2. Экспериментальная фаза 2
    1. Снова подготовьте мышь, как описано в разделе 1, к введению второго контрастного вещества через 10 дней после окончательного считывания первого контрастного вещества (48 ч ПИ).
    2. Выполните шаги 2.1-2.2.
    3. Рассчитайте и приготовьте объем второго контрастного вещества, которое необходимо ввести в неразбавленной дозе 8 мкл/г массы тела для максимального контрастирования.
    4. Подготовьте катетер для хвостовой вены, наполнив его физиологическим раствором и подключив к шприцу, наполненному контрастным веществом.
    5. Сделайте предварительное КБ с контрастированием и исходное сканирование печени для оценки относительного объема крови и стеатоза печени.
    6. Убедитесь, что при сканировании не обнаруживается контрастное вещество, что свидетельствует о полном удалении первого контрастного вещества.
    7. Введите предварительно заполненный катетер в хвостовую вену и введите контрастное вещество с помощью внутривенной инъекции, выполняемой медленно и вручную, продолжительностью 1-3 минуты (не в виде болюсной инъекции). Шприцевой насос можно использовать, если он настроен на соответствующую скорость инфузии.
    8. Проводите сканирование ББ и печени в разные моменты времени, как указано в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сканирование ББ проводится через 10 мин и 4 ч ПИ. Значительный промежуток времени между ними позволяет оценить биораспределение индикатора в организме, а также его относительный клиренс.

4. Извлечение и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе предусмотрены этапы извлечения и анализа данных на основе специального программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов). Описанные шаги могут потребоваться адаптировать при использовании другого программного обеспечения.

  1. Оценка липидного отложения/стеатоза печени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки стеатоза печени контрастное вещество не используется, а проводится сравнение контроля и патологии. Из-за относительно высоких отклонений в свойствах ослабления тканей у разных мышей значения плотности нормализуются для печени по отношению к селезенке (безжировая ткань) и жиру (абсолютная жировая ткань) в соответствии со следующим уравнением и как описано ранее25:
    figure-protocol-7220
    1. Чтобы выполнить анализ, загрузите DICOM-файл сканирования перед контрастированием и отрегулируйте полосу/контрастное вещество, чтобы четко видеть печень, селезенку и белую жировую ткань (WAT).
    2. Откройте инструмент Оператор моделирования с помощью выпадающего меню на передней панели и выберите 3D ROI Tool.
    3. В разделе Оператор 3D ROI выберите Добавить ROI, чтобы создать несколько ROI (до восьми для каждой ткани) для выполнения выборки в областях, где печень (предпочтительно в области левой медиальной доли, правой медиальной доли и левой боковой доли) и селезенка выглядят чистыми, без видимых кровеносных сосудов и жира.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для ВАТ ROI выбираются в середине депо висцеральной жировой ткани. Рекомендуемые области показаны на рисунке 2. Методы нормализации с использованием соотношения печень/селезенка и без включения ВАТ также могут быть применены, как это было установлено ранее31.
    4. В разделе Режим 3D-рисования и функция Erode/Dilate выберите 2D и используйте появившийся интерфейс, чтобы указать имя и цвет для каждого ROI.
    5. Используйте инструмент Sphere paint ROI диаметром 8 пикселей, чтобы вручную нарисовать 2D-ROI.
    6. Выполните выборку, сегментировав 2D-ROI по областям интереса с помощью инструмента Перекрестие (Cross Hair ) в поперечной плоскости, как показано на рисунке 3A.
    7. Щелкните по выбранной точке в сагиттальной и корональной плоскостях, чтобы завершить сегментацию 2D ROI, как показано на рисунке 3B.
    8. Повторите процесс определения остальных ROI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При отборе проб избегайте областей, граничных с органами, так как это может привести к появлению шума и повлиять на надежность рассчитанного значения единицы Хаунсфилда (HU) для каждого ROI.
    9. Если вы удовлетворены сегментированными показателями рентабельности инвестиций, перейдите в раздел Навигация и выберите Показать таблицу, чтобы отобразить таблицу количественной оценки, содержащую рассчитанные значения HU для каждой рентабельности инвестиций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующие значения перечислены в столбце «Среднее», который содержит средние числовые значения вокселей (HU), содержащихся в ROI для интересующих органов. Запишите интересующие вас значения или сохраните всю таблицу, выбрав Экспортировать таблицу.
    10. Рассчитайте средний HU для печени, селезенки и ВАТ и подставьте значения в приведенное выше уравнение, чтобы рассчитать процентное содержание жира в печени.
  2. Функциональный захват тканей / перенос липидов (хиломикрон) в печени
    ПРИМЕЧАНИЕ: Функциональный захват тканей / перенос липидов (хиломикрон) анализируется по полученным снимкам через 45 мин и 48 ч после первой инфузии контрастного вещества на основе ранее опубликованного метода32. Контраст рассчитывается для различных тканей и моментов времени по следующему уравнению:
    figure-protocol-10512
    PV орган t i — среднее значение пикселя в органе в момент времени t i (в диапазоне от 0 ч до 48 ч), а PV орган t0 — среднее значение пикселя в органе на изображении без контраста.
    1. Чтобы выполнить этот анализ, загрузите файл DICOM-сканирования eXIA и отрегулируйте полосу/контрастное вещество, чтобы четко видеть печень, селезенку и левый желудочек.
    2. Откройте оператор моделирования с помощью выпадающего меню инструмента на передней панели и выберите 3D ROI Tool.
    3. В разделе « Оператор 3D-окупаемости» выберите «Добавить рентабельность инвестиций», чтобы сегментировать несколько показателей рентабельности инвестиций для печени.
    4. В разделе « Режим 3D-рисования» и «Эрозия/расширение » используйте инструмент «Окупаемость инвестиций в краску сферы » диаметром 8 пикселей и эрозией −1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите несколько ROI на срезах, где каждый орган четко виден. Избегайте пограничных областей, так как это может привести к появлению шума и повлиять на надежность рассчитанного значения HU для каждого ROI. Это приведет к выборке нескольких 3D-ROI, которые соответствуют небольшим объемам органов.
    5. Используйте появившийся интерфейс, чтобы указать имя и цвет для каждого ROI.
    6. После того, как вы будете удовлетворены спроектированными значениями рентабельности инвестиций, перейдите в раздел Навигация и выберите Показать таблицу , чтобы отобразить таблицу количественной оценки, содержащую рассчитанные значения HU для каждой рентабельности инвестиций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующие значения перечислены в столбце «Среднее», в котором отображаются средние числовые значения вокселей (HU), включенных в ROI. Среднее значение HU ROI каждого органа соответствует PV органа ti. Запишите интересующие вас значения или сохраните всю таблицу, выбрав Экспортировать таблицу.
    7. Чтобы получить ФВ органа t0, повторите все вышеперечисленные шаги, используя DICOM-файл до контрастирования, чтобы рассчитать среднюю яркость печени, селезенки и левого желудочка перед введением контрастного вещества.
    8. Вставьте значения в приведенное выше уравнение, чтобы извлечь процентное контрастное значение, соответствующее функциональному поглощению тканей / переносу липидов (хиломикрон).
  3. Строение и плотность сосудистой сети печени
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ архитектуры и плотности сосудистой сети печени основан на ранее опубликованной методике33 и выполняется на сканировании печени, полученном через 10 мин ПИ второго контрастного вещества.
    1. Чтобы выполнить этот анализ, загрузите файл ExiTron scan DICOM и отрегулируйте полосу/контраст, чтобы четко видеть сосудистую сеть печени.
    2. Откройте оператор моделирования с помощью выпадающего меню инструмента на передней панели и выберите 3D ROI Tool.
    3. В разделе « Оператор 3D-окупаемости» выберите « Добавить рентабельность инвестиций», чтобы создать 3D-окупаемость инвестиций для печени.
    4. В разделе « Режим 3D-рисования» и «Размытие/расширение» выберите «3D».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инструмент Sphere paint ROI с эрозией −1 для определения слоев сегментации в корональной плоскости. Диаметр инструмента рисования ROI должен быть отрегулирован в соответствии с каждым слоем (для добавления/удаления любых желательных/нежелательных выделений вокселов). Рекомендуется, чтобы объем печени был первоначально определен в корональной плоскости, а затем поперечная и сагиттальная плоскости могут быть использованы для коррекции ROI. Этот процесс требует точности. Пользователь должен быть очень осторожен, чтобы не включать другие ткани, сосуды и кости при сегментации каждого слоя ROI, при этом гарантируя, что все области печени включены в определенный ROI. По этой причине ознакомление с анатомическими границами печени имеет решающее значение.
    5. После того, как вы удовлетворены полученным ROI печени, выполните разрез, чтобы удалить из данных изображения все вокселы, которые не относятся к первоначально сегментированному ROI печени. Для этого выберите ROI печени в селекторе ROI и нажмите на значок Perform Cut . Эта операция убирает фон и оставляет ROI печени неизменным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что функции отмены/повтора применимы ко всем операциям, выполняемым с помощью инструмента 3D ROI, действие вырезания ROI не может быть отменено. Таким образом, перед этим действием пользователь может рассмотреть возможность сохранения первоначального ROI печени в формате DICOM.
    6. Результирующая РОИ печени включает в себя сосудистую сеть и окружающие ткани, которые необходимо удалить. Для этого сбросьте ROI печени, нажав на кнопку Reset ROI broom.
    7. Используйте появившийся интерфейс, чтобы перенести все пиксели ROI печени на задний план.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этой операции ROI печени все еще будет существовать, но она больше не будет содержать никаких вокселей.
    8. Чтобы пересегментировать ROI печени таким образом, чтобы он содержал только пиксели, связанные с сосудистой системой, перейдите в раздел Алгоритмы сегментации, обозначенные значком волшебной палочки, и выберите Подключенное пороговое значение.
    9. Определите ROI как Выходные данные и фон как Входные данные в раскрывающемся меню ввода, прежде чем применять пороговые значения.
    10. Установите пороговые значения, щелкнув значки Min и Max слева от каждого поля порога, чтобы заполнить максимальное и минимальное значения и получить сосудистую сеть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только пиксели в выбранном диапазоне будут включены в результирующую рентабельность инвестиций. Регулировка пороговых значений у разных животных гарантирует, что одни и те же анатомические области будут учитываться в отношении точного количества контрастного вещества, вводимого каждому животному. Этот показатель постоянен для выбранных тканей, даже если числовые значения не идентичны.
    11. С помощью инструмента « Перекрестие » щёлкните по точке, где сосудистая сеть кажется четкой, и щёлкните по кнопке «Применить », чтобы выполнить сегментацию.
    12. Активируйте средство просмотра проекции максимальной интенсивности (MIP).
    13. Оцените результирующую рентабельность инвестиций печени с точки зрения того, насколько четкой выглядит сосудистая сеть в представлении MIP.
    14. Если ткань остается в отдельных частях ROI печени, повторите шаги 4.3.5-4.3.11, регулируя пороговое значение Min до тех пор, пока сегментированный ROI печени четко не будет представлять сосудистую сеть.
    15. После того, как вы будете удовлетворены полученной рентабельностью инвестиций в печень, создайте таблицу количественной оценки, содержащую рассчитанный объем ROI печени в кубических миллиметрах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующие значения перечислены в столбце «мм3», который содержит числовое значение объема вокселей (HU), содержащихся в ROI печени. Запишите интересующие вас значения или сохраните всю таблицу, выбрав Экспортировать таблицу.
  4. Относительный объем крови в печени
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения относительного объема крови в печени (rBV), который значительно коррелирует с количеством новообразованных кровеносных сосудов во время прогрессирования фиброза, используют предконтрастное сканирование и сканирование через 4 ч после второй инъекции контрастного вещества. Анализ выполняют, как описано ранее34.
    1. Чтобы выполнить этот анализ, загрузите файл ExiTron сканирования DICOM и отрегулируйте полосу/контрастность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отключите программу просмотра MIP: в разделе «Настройки» установите флажок, чтобы отключить программу просмотра MIP при загрузке. Для больших наборов данных это может повысить скорость загрузки.
    2. Откройте оператор моделирования с помощью выпадающего меню инструмента на передней панели и выберите 3D ROI Tool. Этот инструмент предоставляет расширенные возможности для рисования, визуализации, сохранения и количественной оценки как 2D, так и 3D областей.
    3. В разделе 3D ROI Operator выберите Add ROI и сегментируйте два ROI: один для печени и один для крупного кровеносного сосуда.
    4. В разделе « Режим 3D-рисования» и «Размытие/расширение» выберите «2D».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать инструмент Sphere paint ROI диаметром 8-10 пикселей для печени и 4-6 пикселей для кровеносного сосуда. Тем не менее, диаметр инструмента для рисования можно регулировать в зависимости от того, насколько мала выделенная область.
    5. Используйте появившийся интерфейс, чтобы указать имя и цвет для каждого ROI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите от двух до пяти срезов центральных частей интересующих тканей и определите слои сегментации, чтобы получить 2D-ROI для каждой ткани. При выборе областей на каждом срезе избегайте областей границы органа, как показано на рисунке 4, так как это может привести к появлению шума и повлиять на надежность рассчитанного значения HU для каждого ROI.
    6. После того, как вы будете удовлетворены спроектированными значениями рентабельности инвестиций, перейдите в раздел Навигация и выберите Показать таблицу , чтобы отобразить таблицу количественной оценки, содержащую рассчитанные значения HU для каждой рентабельности инвестиций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующие значения перечислены в столбце «Среднее», в котором отображаются средние числовые значения вокселей (HU), включенных в ROI. Запишите интересующие вас значения или сохраните всю таблицу, выбрав Экспортировать таблицу.
    7. Повторите все шаги для DICOM-файла до введения контрастного вещества, чтобы получить среднюю яркость печени до введения контрастного вещества. Для этого выполните шаги 4.4.2-4.4.5 только для печени.
    8. Вычислите средние значения HU для каждой ткани в эквивалентные моменты времени и вставьте полученные значения в уравнение ниже:
      figure-protocol-21274
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крупный кровеносный сосуд после введения контрастного вещества считается 100% рБВ, а печень до введения контрастного вещества считается 0% рБВ.
  5. Диаметр воротной вены
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения диаметра воротной вены анализируются те же сканы, которые используются для измерения рБВ печени, как описано ранее35.
    1. Загрузите DICOM-файл сканирования ExiTron и отрегулируйте полосу/контрастность.
    2. Расположите поперечные плоскости трех-четырех срезов над местом соединения верхней брыжеечной и селезеночной вен (рис. 5).
    3. Используйте инструмент « Линейка », чтобы измерить точное расстояние между двумя точками (т. е. диаметр области круглой жилы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние извлекается на изображении, но можно также перейти в раздел Навигация и выбрать Показать таблицу, чтобы отобразить таблицу количественной оценки, содержащую рассчитанное расстояние, или выбрать Экспортировать таблицу, чтобы сохранить результат.

Результаты

В этом репрезентативном исследовании микро-КТ без какого-либо контрастного вещества показала более высокий процент жира в печени у мышей с НАЖБП по сравнению с контрольной группой (табл. 2), что подтверждает патологию. С помощью контрастного вещества ExiTron и описанного выше анал...

Обсуждение

В настоящее время рекомендуемым методом диагностики и определения стадии НАЖБП у людей является биопсия печени, которая таит в себе риск осложнений кровотечения, а также неточностей отбора проб40. Напротив, на животных моделях такой диагноз ставится путем гистологическог?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com. Эта работа была поддержана Греческим фондом исследований и инноваций (#3222 to A.C.). Анна Хаджихамби финансируется Институтом гепатологии Роджера Уильямса, Фондом исследований печени.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
eXIA160Binitio Biomedical, Inc.https://www.binitio.com/?Page=Products
High fat diet with 60% of kilocalories from fatResearch Diets, New Brunswick, NJ, USAD12492
High-fructose corn syrup Best flavors, CAhfcs-1gallon
Lacrinorm ophthalmic ointment Bausch & Lomb
Normal diet with 10% of kilocalories from fat Research Diets, New Brunswick, NJ, USAD12450
Viscover ExiTron nano 12000 Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-095-698
VivoQuantInvicro
X-CUBE Molecubes, Belgiumhttps://www.molecubes.com/systems/

Ссылки

  1. Lazarus, J. V., et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 19 (1), 60-78 (2022).
  2. Takahashi, Y., Fukusato, T. Histopathology of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15539-15548 (2014).
  3. Huang, D. Q., El-Serag, H. B., Loomba, R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: Trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 18 (4), 223-238 (2021).
  4. Niederseer, D., Wernly, B., Aigner, E., Stickel, F., Datz, C. NAFLD and cardiovascular diseases: Epidemiological, mechanistic and therapeutic considerations. Journal of Clinical Medicine. 10 (3), 467 (2021).
  5. Lefere, S., et al. Differential effects of selective- and pan-PPAR agonists on experimental steatohepatitis and hepatic macrophages. Journal of Hepatology. 73 (4), 757-770 (2020).
  6. Chrysavgis, L., Papatheodoridi, A. M., Chatzigeorgiou, A., Cholongitas, E. The impact of sodium glucose co-transporter 2 inhibitors on non-alcoholic fatty liver disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 36 (4), 893-909 (2021).
  7. Li, M., Qian, M., Xu, J. Vascular endothelial regulation of obesity-associated insulin resistance. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 51 (2017).
  8. Pi, X., Xie, L., Patterson, C. Emerging roles of vascular endothelium in metabolic homeostasis. Circulation Research. 123 (4), 477-494 (2018).
  9. Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  10. Koyama, Y., Brenner, D. A. Liver inflammation and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 55-64 (2017).
  11. Nasiri-Ansari, N., et al. Endothelial cell dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): A concise review. Cells. 11 (16), 2511 (2022).
  12. Lefere, S., et al. Angiopoietin-2 promotes pathological angiogenesis and is a therapeutic target in murine non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 69 (3), 1087-1104 (2019).
  13. Pasarin, M., et al. Insulin resistance and liver microcirculation in a rat model of early NAFLD. Journal of Hepatology. 55 (5), 1095-1102 (2011).
  14. Hammoutene, A., Rautou, P. E. Role of liver sinusoidal endothelial cells in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 70 (6), 1278-1291 (2019).
  15. Sun, X., Harris, E. N. New aspects of hepatic endothelial cells in physiology and non-alcoholic fatty liver disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 318 (6), C1200-C1213 (2020).
  16. Iwakiri, Y., Shah, V., Rockey, D. C. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis - current status and future directions. Journal of Hepatology. 61 (4), 912-924 (2014).
  17. Baffy, G. Origins of portal hypertension in non-alcoholic fatty liver disease. Digestive Diseases and Sciences. 63 (3), 563-576 (2018).
  18. Ruhli, F. J., Kuhn, G., Evison, R., Muller, R., Schultz, M. Diagnostic value of micro-CT in comparison with histology in the qualitative assessment of historical human skull bone pathologies. American Journal of Physical Anthropology. 133 (4), 1099-1111 (2007).
  19. Rodt, T., et al. Micro-computed tomography of pulmonary fibrosis in mice induced by adenoviral gene transfer of biologically active transforming growth factor-beta1. Respiratory Research. 11 (1), 181 (2010).
  20. Deng, L., Xiao, S. M., Qiang, J. W., Li, Y. A., Zhang, Y. Early lung adenocarcinoma in mice: Micro-computed tomography manifestations and correlation with pathology. Translational Oncology. 10 (3), 311-317 (2017).
  21. Feng, J., et al. Abnormalities in the enamel in bmp2-deficient mice. Cells, Tissues, Organs. 194 (2-4), 216-221 (2011).
  22. Kagadis, G. C., Loudos, G., Katsanos, K., Langer, S. G., Nikiforidis, G. C. In vivo small animal imaging: current status and future prospects. Medical Physics. 37 (12), 6421-6442 (2010).
  23. Starosolski, Z., et al. Ultra high-resolution in vivo computed tomography imaging of mouse cerebrovasculature using a long circulating blood pool contrast agent. Scientific Reports. 5, 10178 (2015).
  24. Caussy, C., Reeder, S. B., Sirlin, C. B., Noninvasive Loomba, R. quantitative assessment of liver fat by MRI-PDFF as an endpoint in NASH trials. Hepatology. 68 (2), 763-772 (2018).
  25. Lubura, M., et al. Non-invasive quantification of white and brown adipose tissues and liver fat content by computed tomography in mice. PLoS One. 7 (5), e37026 (2012).
  26. Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 18 (7), e3000410 (2020).
  27. Tetri, L. H., Basaranoglu, M., Brunt, E. M., Yerian, L. M., Neuschwander-Tetri, B. A. Severe NAFLD with hepatic necroinflammatory changes in mice fed trans fats and a high-fructose corn syrup equivalent. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (5), G987-G995 (2008).
  28. Machado, M. V., et al. Mouse models of diet-induced non-alcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One. 10 (5), 0127991 (2015).
  29. Jensen, T., et al. Fructose and sugar: A major mediator of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (5), 1063-1075 (2018).
  30. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  31. De Rudder, M., et al. Automated computerized image analysis for the user-independent evaluation of disease severity in preclinical models of NAFLD/NASH. Laboratory Investigation. 100 (1), 147-160 (2020).
  32. Willekens, I., et al. Time-course of contrast enhancement in spleen and liver with Exia 160, Fenestra LC, and VC. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 128-135 (2009).
  33. Das, N. M., et al. In vivo quantitative microcomputed tomographic analysis of vasculature and organs in a normal and diseased mouse model. PLoS One. 11 (2), e0150085 (2016).
  34. Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. 63 (12), 1960-1971 (2014).
  35. Zhang, J., et al. Gamna-Gandy bodies of the spleen detected with susceptibility weighted imaging: maybe a new potential non-invasive marker of esophageal varices. PLoS One. 8 (1), e55626 (2013).
  36. Chen, Y., Li, J., Zhou, Q., Lyu, G., Li, S. Detection of liver and spleen stiffness in rats with portal hypertension by two-dimensional shear wave elastography. BMC Medical Imaging. 22 (1), 68 (2022).
  37. Lessa, A. S., et al. Ultrasound imaging in an experimental model of fatty liver disease and cirrhosis in rats. BMC Veterinary Research. 6, 6 (2010).
  38. Abikhzer, G., Alabed, Y. Z., Azoulay, L., Assayag, J., Rush, C. Altered hepatic metabolic activity in patients with hepatic steatosis on FDG PET/CT. AJR. American Journal of Roentgenology. 196 (1), 176-180 (2011).
  39. Newman, E. M., Rowland, A. A physiologically based pharmacokinetic model to predict the impact of metabolic changes associated with metabolic associated fatty liver disease on drug exposure. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11751 (2022).
  40. Tsai, E., Lee, T. P. Diagnosis and evaluation of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis, including noninvasive biomarkers and transient elastography. Clinics in Liver Disease. 22 (1), 73-92 (2018).
  41. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments. 146, e59130 (2019).
  42. Boll, H., et al. Comparison of Fenestra LC, ExiTron nano 6000, and ExiTron nano 12000 for micro-CT imaging of liver and spleen in mice. Academic Radiology. 20 (9), 1137-1143 (2013).
  43. Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
  44. Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: Comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
  45. Toczek, J., et al. Computed tomography imaging of macrophage phagocytic activity in abdominal aortic aneurysm. Theranostics. 11 (12), 5876-5888 (2021).
  46. Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media & Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены