* Эти авторы внесли равный вклад
Оптогенетическое манипулирование сигнальными путями может быть мощной стратегией для изучения того, как сигнализация расшифровывается в развитии, регенерации, гомеостазе и заболевании. Этот протокол содержит практические рекомендации по использованию сигнальных активаторов узловых и костных морфогенных белков (BMP) на основе чувствительных к свету кислороду доменов в раннем эмбрионе рыбки данио.
Сигнальные пути управляют фундаментальными биологическими процессами, включая развитие, регенерацию, гомеостаз и болезни. Методы экспериментального манипулирования сигналами необходимы для понимания того, как сигнализация интерпретируется в этих широких контекстах. Молекулярно-оптогенетические инструменты могут обеспечить обратимые, настраиваемые манипуляции активностью сигнальных путей с высокой степенью пространственно-временного контроля и применяются in vitro, ex vivo и in vivo. Эти инструменты объединяют светочувствительные белковые домены, такие как гомодимеризирующий домен LOV (LOV) в синем свете, с сигнальными эффекторами для обеспечения светозависимого экспериментального контроля над сигналами. Этот протокол содержит практические рекомендации по использованию костного морфогенетического белка (BMP) на основе LOV и узловых сигнальных активаторов bOpto-BMP и bOpto-Nodal в оптически доступном раннем эмбрионе рыбки данио. В ней описаны два контрольных эксперимента: быстрый анализ фенотипа для определения подходящих условий эксперимента и иммунофлуоресцентный анализ для непосредственной оценки передачи сигналов. Вместе эти контрольные эксперименты могут помочь создать конвейер для использования оптогенетических инструментов на ранних эмбрионах рыбок данио. Эти стратегии предоставляют мощную платформу для изучения роли сигналов в развитии, здоровье и физиологии.
Сигнальные пути позволяют клеткам реагировать на окружающую среду и координировать действия в масштабах всей ткани и организма. Сигналы, имеющие решающее значение для эмбрионального развития, включают членов суперсемейства TGF-beta, костный морфогенетический белок (BMP) и Nodal 1,2,3. Во время эмбриогенеза пути, регулируемые этими и другими сигналами, формируют план тела, контролируя экспрессию генов и дополнительные процессы, чтобы гарантировать, что различные ткани и органы развиваются и взаимодействуют должным образом. Патологии, в том числе врожденные дефекты и рак, могут возникать при нарушении передачи сигналов или реакций на передачу сигналов 4,5,6,7. Несмотря на тщательные исследования сигнализации, многое еще предстоит выяснить о том, как уровни и динамика декодируются в различных контекстах 8,9,10,11, особенно во время развития 12,13,14,15,16,17,18,19.
Чтобы понять, как декодируется сигнализация, идеальным экспериментом было бы манипулирование уровнями сигналов, временем и/или динамикой — с высокой степенью пространственного и временного контроля — и оценка результатов. Например, предложены точные пространственные сигнальные градиенты для моделирования развивающихся тканей20,21. Изменение пространственных распределений сигнального градиента помогло бы проверить эту гипотезу22. Кроме того, становится все более очевидной важность сигнальной динамики в генерировании разнообразных клеточных ответов: один и тот же сигнальный путь может инструктировать клетки дифференцироваться или пролиферировать в зависимости от частоты передачи сигналов, например, 9,23. Экспериментальные парадигмы, в которых можно легко манипулировать динамикой сигналов, будут полезны для изучения взаимосвязи между динамикой и решениями о судьбе клеток 8,12,13,14,15.
Исторически сложилось так, что для манипулирования сигналами в контексте развития использовалось множество методов, что привело к фундаментальным открытиям 1,2,3. Передача сигналов может быть заблокирована с помощью мутантов с потерей функции, экспрессии ингибиторов эктопии или препаратов-антагонистов. Методы активации сигнализации включают препараты-агонисты, рекомбинантные лиганды, эктопическую экспрессию лигандов или конститутивно активных рецепторов, а также мутанты ингибиторов путей с потерей функции. Эти методы варьируются в континууме экспериментального контроля. Например, мутанты и эктопическая экспрессия могут оказаться на стороне кувалды континуума: при таких подходах драматические, системные изменения в активности путей могут вызвать раннюю смерть и препятствовать исследованиям на более поздних стадиях, или со временем могут привести к плейотропным эффектам, которые трудно отделить друг от друга. Кроме того, часто бывает сложно независимо манипулировать одним сигнальным признаком за раз, таким как уровень или длительность. На другом конце континуума некоторые методы предлагают более точный экспериментальный контроль, такие как микрофлюидные устройства, которые подвергают образцы воздействию лекарств или рекомбинантных белков с временным, а иногда и пространственным контролем 18,24,25, или генетические методы, включая индуцируемые тепловым шоком и тканеспецифичные промоторы, которые могут предложить аналогичные преимущества16,26,27. Однако эти методы могут быть сложными в исполнении, могут быть необратимыми, могут иметь относительно медленную кинетику или плохое разрешение, а также могут быть недоступны в некоторых модельных системах.
Молекулярно-оптогенетические подходы являются мощным дополнением к этому инструментарию. Эти подходы используют белки, которые реагируют на различные длины волн света, для манипулирования биологическими процессами, включая передачу сигналов 8,12,13,14,15, и разрабатывались в течение десятилетий для использования в различных системах от клеточных культур до цельных животных 12,13,28. По сравнению с исторически сложившимися подходами, молекулярная оптогенетика часто может предложить более высокую степень пространственно-временного контроля над биологическими процессами: регулятором в оптогенетических системах является свет, а управление длиной волны, интенсивностью, продолжительностью и частотой воздействия света относительно простое. С помощью сложных систем, таких как конфокальные и двухфотонные микроскопы, возможно пространственное управление в субклеточном диапазоне 29,30,31. Инструменты для оптогенетического манипулирования сигналами были разработаны и применены в нескольких системах, в том числе описанных в Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 и Huang et al.34. Например, используя пространственный контроль, обеспечиваемый оптогенетикой, эта стратегия была недавно использована для модификации сигнального градиента у эмбрионов дрозофилы, демонстрируя, что эмбриогенез мух удивительно устойчив к изменениям этого градиента22. Обратимость и быстрая кинетика включения и выключения оптогенетических сигнальных активаторов также сделали их привлекательными инструментами для исследования расшифровки сигнальной динамики 8,12,13,14,15,34,35,36.
Ранний эмбрион данио-рерио представляет собой систему in vivo , хорошо подходящую для оптогенетических исследований, поскольку она оплодотворяется извне, прозрачна, удобна для микроскопии и генетически поддается лечению. Воздействие света легче доставлять эмбрионам, которые развиваются вне матери, свет может проникать и получать доступ к их непрозрачным тканям, живые эмбрионы рыбок данио-рерио хорошо переносят визуализацию (в дополнение к тому, что они прозрачны), а существующие генетические методы предоставляют прямые возможности для экспериментов по нокдауну и гиперэкспрессии, в дополнение к разработке полезныхтрансгенных препаратов.
Недавно были разработаны оптогенетические инструменты для активации передачи сигналов BMP38 и Nodal39 у эмбрионов рыбок данио при воздействии синего света (рис. 1). Мы называем эти инструменты bOpto-BMP и bOpto-Nodal (b — активируемый синим светом и Opto — оптогенетический). bOpto-BMP/Nodal основаны на схожих механизмах активации путей. Связывание BMP или узловых лигандов с соответствующими рецепторными серин-треонинкиназами приводит к взаимодействию рецепторных киназных доменов, которые приводят к фосфорилированию сигнальных эффекторов (Smad1/5/9 для BMP и Smad2/3 для узлов). Фосфорилированные сигнальные эффекторы затем транслоцируются в ядро и регулируют экспрессию гена-мишени3 (рис. 1A, D). Эти взаимодействия рецепторных киназ можно сделать светочувствительными, связав рецепторные киназы со светочувствительными димеризирующими белками: при воздействии света эти химерные белки должны димеризироваться, заставляя рецепторные киназные домены взаимодействовать и активировать передачу сигналов (рис. 1B, C, E, F). Важно отметить, что, в отличие от эндогенных рецепторов, bOpto-BMP/Nodal не содержат внеклеточных лиганд-связывающих доменов, обеспечивая лиганд-независимую активность (рис. 1C, F). Эта стратегия оптогенетической активации была сначала достигнута с рецепторными тирозинкиназами40,41,42, а затем применена к рецепторным серин-треонинкиназам.
bOpto-BMP/Nodal использует чувствительный к синему свету (~450 нм) гомодимеризирующий свет-кислород-напряжение-чувствительный домен (LOV) из водоросли Vaucheria fridiga белок AUREO1 (VfLOV)43,44. Эти конструкции состоят из мембранно-нацеленного мотива миристоилирования, за которым следуют домены киназы BMP или узлового рецептора, слитые с доменом LOV (рис. 1B, E). Воздействие синего света должно вызывать гомодимеризацию LOV, что приводит к взаимодействию доменов рецепторкиназы, которые приводят к соответствующему фосфорилированию Smad и активации путей (рис. 1C, F). Для bOpto-BMP было обнаружено, что комбинация конструкций с рецепторными киназными доменами I типа из Acvr1l (также известных как Alk8) и BMPR1aa (также известных как Alk3) и рецепторным киназным доменом II типа из BMPR2a оптимально активирует сигнализацию38 (Addgene #207614, #207615 и #207616). Для bOpto-Nodal используется комбинация конструкций с рецепторным киназным доменом I типа из Acvr1ba и рецепторным киназным доменом II типа из Acvr2ba39.
bOpto-BMP/Nodal были введены в ранние эмбрионы данио-рерио путем инъекции мРНК на одноклеточной стадии и использованы для изучения роли продолжительности передачи сигналов в узловой интерпретации39, для определения того, почему данио-рерио теряют способность реагировать на узел45, и для изучения того, как гены-мишени BMP реагируют на различные уровни передачи сигналов BMP38. Вполне вероятно, что эти инструменты будут по-прежнему полезны в широком спектре будущих расследований. Однако сила оптогенетических сигнальных активаторов также является их слабостью: со светочувствительными образцами следует обращаться с осторожностью, чтобы избежать непреднамеренной эктопической сигнальной активности. Воздействие комнатного света или солнечного света может активировать bOpto-BMP/Nodal.
В этом протоколе содержатся практические рекомендации по использованию кодируемых мРНК LOV-активаторов BMP и Nodal в ранних эмбрионах рыбок данио. Он начинается с подробного описания одной из стратегий создания светового короба для управления равномерным освещением и температурой (Рисунок 2, Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2, Дополнительный файл 3, Дополнительный файл 4, Дополнительный файл 5, Дополнительный файл 6, Дополнительный файл 7, Дополнительный файл 8). Затем описываются два ключевых контрольных эксперимента, которые определяют, ведет ли оптогенетический сигнальный активатор себя так, как ожидалось, т.е. активирует активность проводящих путей только при воздействии света (рис. 3). Первый контрольный анализ включает в себя изучение фенотипов через один день после оплодотворения у эмбрионов, подвергшихся воздействию света, и эмбрионов, не подвергшихся воздействию света (рис. 3А). Эмбрионы, подвергшиеся воздействию света с помощью мРНК, но не необлученные эмбрионы, должны фенокопировать BMP или узловую гиперэкспрессию (рис. 4A, B; Фенотипы BMP, в частности, четко различимы в этой точкевремени 46). Этот анализ обеспечивает быстрое считывание активности. Во втором контрольном анализе, чтобы определить, вызваны ли фенотипы конкретно избытком BMP или узловой сигнализации, и непосредственно наблюдать за изменением уровней сигнализации, используется иммунофлуоресцентное окрашивание для обнаружения фосфорилированных сигнальных эффекторов (pSmad1/5/9 или pSmad2/3, соответственно) после 20-минутного воздействия света на поздней стадии бластулы / ранней гаструляции, когда сигнальная активность была хорошо описана12. 16,17,47,48,49,50 (рисунок 3Б и рисунок 4В). (Обратите внимание, что, несмотря на то, что пространственно локализованная активация была продемонстрирована как для bOpto-BMP38, так и для bOpto-Nodal39, этот протокол описывает только однородное воздействие света и стратегии активации сигналов.) Рекомендуется проводить эти контрольные эксперименты до применения bOpto-BMP/Nodal к конкретным исследовательским вопросам, чтобы определить идеальные локальные условия эксперимента.
Протоколы исследований данио-рерио были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию при Национальных институтах здравоохранения (ASP 21-008). Все исследования рыбок данио-рерио проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Сборка светового короба
2. Генерация мРНК для инъекций
ПРИМЕЧАНИЕ: pCS2+ является векторной основой для конструкций bOpto-BMP38 и bOpto-Nodal39. Этот переносчик устойчив к ампициллину. bOpto-BMP состоит из трех конструкций (рис. 1B): BMPR1aa-LOV (Addgene # 207614): предполагаемый домен киназы рецептора BMPR1aa типа I (также известный как Alk3), слившийся с LOV; Acvr1l-LOV (Addgene # 207615): предполагаемый киназный домен рецептора Acvr1l типа I (также известный как Alk8), слитый с LOV; и BMPR2a-LOV (Addgene # 207616): предполагаемый киназный домен рецептора BMPR2a типа II и следующий за ним С-концевой домен, слитый с LOV. bOpto-Nodal состоит из двух конструкций (рис. 1E): Acvr1ba-LOV: предполагаемый киназный домен рецептора Acvr1ba типа I (также известный как Acvr1b), слитый с LOV; Acvr2ba-LOV: предполагаемый киназный домен рецептора Acvr2ba типа II (также известный как Acvr2b), слитый с LOV.
3. Инъекция мРНК
4. Эксперимент с экспозицией света
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздействие света ~450 нм с интенсивностью излучения 45 Вт/м2 надежно активирует bOpto-BMP/Nodal без явной фототоксичности (информацию о экспонометре см. в таблице материалов). Уровень оптогенетически активированной сигнализации может быть настроен путем изменения значений освещенности38. Тем не менее, фототоксичность необходимо будет оценивать при более высокой интенсивности облучения.
5. Оценка эксперимента
Цель двух описанных здесь контрольных экспериментов состоит в том, чтобы определить, активируют ли bOpto-BMP/Nodal свои соответствующие пути в ответ на воздействие синего света, не влияя на передачу сигналов в отсутствие света, как ожидалось. Используйте эти элементы управления, чтобы установить соответствующий экспериментальный рабочий процесс в вашей лаборатории, прежде чем применять bOpto-BMP/Nodal к интересующим вас исследовательским вопросам.
Анализ фенотипирования может быть завершен всего за 2 дня и дает полезное представление о сигнальной активности и фототоксичности (рис. 3A). Эмбрионы, подвергшиеся воздействию синего света, должны фенокопировать избыточную передачу сигналов BMP (вентризация46; Рисунок 4А, левая панель) или Узловая сигнализация (дефекты развития, связанные с экстрамезендодермой 1,3,47,57,58,59,60 (Рисунок 4А, правая панель)). При инъекции эмбрионы, подвергшиеся воздействию света, являются афенотипными, проверьте качество мРНК и рассмотрите возможность введения большего количества инъекций, а также перепроверьте стратегию воздействия света, чтобы обеспечить постоянное воздействие яркого света (~450 нм света с интенсивностью излучения 45 Вт/м2 должен сильно активировать передачу сигналов). Напротив, инъекционные, необлученные эмбрионы должны выглядеть идентично неинъекционным братьям и сестрам. При инъекции необлученные эмбрионы демонстрируют фенотипы, уменьшают количество введенной мРНК и пересматривают экспериментальную установку, чтобы убедиться, что необлученные эмбрионы защищены от воздействия света. Данные, представленные на рисунке 4B, показывают результаты типичных экспериментов по фенотипированию с соответствующими количествами мРНК и условиями воздействия: сильная сигнальная активность очевидна у инъецированных, подвергшихся воздействию света эмбрионов, и только небольшая часть инъецированных, необлученных эмбрионов демонстрирует фенотипы.
Анализ на фенотипирование также дает возможность оценить фототоксичность. Если фототоксичность незначительна, неинъекционные, подвергшиеся воздействию света эмбрионы должны выглядеть дикого типа, похожими на неинъецированные, необлученные эмбрионы. Если неинъекционные, подвергшиеся воздействию света эмбрионы имеют дефекты, но не неинъецированные, необлученные эмбрионы, подумайте о том, чтобы уменьшить световое излучение. Излучение 45 Вт/м2 надежно активирует передачу сигналов без явной фототоксичности. Данные, представленные на рисунке 4B , не показывают никаких тревожных различий между невведенными, световыми и неинъецированными, необлученными эмбрионами, что указывает на пренебрежимо малую фототоксичность.
Несмотря на то, что иммунофлуоресцентный анализ требует больше времени и усилий (~1 неделя) по сравнению с фенотипированием (2 дня), иммунофлуоресцентное окрашивание обеспечивает прямое считывание активности сигнального пути и может выявить тонкие сигнальные изменения, которые могут не отражаться в общей морфологии. Иммунофлуоресценция особенно важна для оценки ответов на bOpto-Nodal, поскольку избыток узловой сигнализации часто приводит к лизицизму эмбрионов на 1 dpf, что может иметь множество причин, в отличие от специфических вентralизационных фенотипов, характерных для избыточной передачи сигналов BMP46 (рис. 4A). Эмбрионы, подвергшиеся воздействию синего света, должны демонстрировать равномерное увеличение фосфорилирования Smad1/5/9 или Smad2/3 по сравнению с эмбрионами, не подвергшимися воздействию света. Если уровни не повышаются или повышаются лишь незначительно, проверьте качество мРНК и подумайте о том, чтобы ввести больше, а также перепроверьте стратегию воздействия света. 20-минутное воздействие синего света с интенсивностью излучения 45 Вт/м2 около 40% эпиболии должно сильно активировать передачу сигналов. Если окрашивание pSmad неоднородное, попробуйте ввести мРНК в центр клетки (а не в желток), что может привести к более равномерному распределению мРНК.
Инъецированные, необлученные эмбрионы должны иметь уровни pSmad, сопоставимые с неинъецированными эмбрионами. Как ни странно, мы наблюдали более герметичное фосфорилирование Smad с bOpto-Nodal, чем bOpto-BMP. Если уровень pSmad повышен в введенных, необлученных эмбрионах, уменьшите количество введенной мРНК. Кроме того, пересмотрите экспериментальную установку, чтобы убедиться, что 1) неэкспонированные эмбрионы не подвергаются случайному воздействию света, и 2) воздействие света во время фиксации минимально. На этапе фиксации критически важно не допустить, чтобы между извлечением из светового короба и погружением в формальдегид прошло не более 45 с. Кроме того, на этом этапе сведите к минимуму воздействие комнатного света и солнечного света, закрыв оконные жалюзи, выключив источники белого света, используя красный свет или накрыв источники белого света синей светоблокирующей гелевой фильтровальной бумагой (Таблица материалов).
Данные, представленные на рисунке 4C , показывают результаты типичных экспериментов по иммунофлуоресцентному окрашиванию с соответствующими количествами мРНК и условиями воздействия света: уровни pSmad одинаковы у неинъецированных и необлученных эмбрионов, в то время как инъецированные эмбрионы, подвергшиеся воздействию света, демонстрируют более высокие уровни фосфорилирования Smad.
Рисунок 1: Стратегия активации bOpto-BMP и -Nodal signaling . (A) Эндогенный сигнальный путь BMP активируется связыванием лиганда BMP, что приводит к образованию рецепторного комплекса I/II типа, фосфорилированию Smad1/5/9 и экспрессии генов-мишеней BMP. Рецепторы I типа BMPR1aa и Acvr1l также известны как Alk3 и Alk8 соответственно. BMPR2a является рецептором II типа. (B) bOpto-BMP конструкции38. Предполагаемые киназные домены BMPR1aa и Acvr1l сливаются с LOV; слияние BMPR2a-LOV содержит предполагаемый киназный домен и рецепторный С-концевой домен (CTD). Все слияния нацелены на мембрану с мотивом миристоилирования (Myr). Домены разделяются глицин-сериновыми (GS) линкерами. Конструкты помечаются в CTD тегом эпитопа HA. Было обнаружено, что эта комбинация из трех конструктов оптимально активирует передачу сигналов BMP. (C) bОпто-BMP-опосредованная активация сигнализации BMP. При воздействии синего света домены LOV димеризируются, что, как полагают, вызывает образование комплексов и активацию сигналов. (D) Эндогенный узловой сигнальный путь активируется связыванием узлового лиганда, что приводит к образованию рецепторного комплекса I/II типа, фосфорилированию Smad2/3 и экспрессии генов-мишеней узлов. Рецептор I типа Acvr1ba и рецептор II типа Acvr2ba также известны как Acvr1b и Acvr2b соответственно. (E) bОптико-узловые конструкции39. Предполагаемые киназные домены из Acvr1ba и Acvr2ba сливаются с LOV. Все слияния нацелены на мембрану с мотивом миристоилирования (Myr). Домены разделяются компоновщиками GS. Конструкты помечаются в CTD тегом эпитопа HA. (F) bОпто-узловая опосредованная активация узловой сигнализации. При воздействии синего света домены LOV димеризируются, что, как полагают, вызывает образование комплексов и активацию сигналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Световой короб с регулируемой температурой для оптогенетических экспериментов . (A) Светодиодный микропластинчатый осветитель крепится к верхней части инкубатора с помощью специально изготовленного светодиодного держателя. Эмбрионы данио-рерио в 6-луночной пластине на первой полке подвергаются воздействию света через отверстие, просверленное в верхней части инкубатора. На нижней полке находится второй набор неэкспонированных контрольных эмбрионов в 6-луночной пластине, обернутой алюминиевой фольгой. Дверца инкубатора облицована уплотнителем, чтобы предотвратить непреднамеренное воздействие комнатного света или солнечного света. (B) Подробная информация о процедуре создания отверстия в инкубаторе с помощью ступенчатого сверла. Используемая здесь модель инкубатора имеет внутреннюю панель, которая требует сверления второго, большего отверстия (Таблица материалов). (C) Деталь специального светодиодного держателя, предназначенного для трехволновой системы освещения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Рабочий процесс эксперимента bOpto-BMP/Nodal. Анализ фенотипа и иммунофлуоресцентное окрашивание pSmad для тестирования активности bOpto-BMP/Nodal. Эмбрионам вводят мРНК на одноклеточной стадии и переносят в световой короб не позднее, чем через 1,5 ч после оплодотворения (hpf). (А) Фенотипический анализ. Эмбрионы с инъекциями и братья и сестры, не получившие инъекции, выращиваются в темноте или подвергаются равномерному воздействию синего света, начиная с 1,5 hpf до 1 дня после оплодотворения (DPF). Оптогенетическая сигнальная активность может быть оценена путем оценки эмбрионов по фенотипам, соответствующим избыточной активности пути. (B) иммунофлуоресцентное окрашивание pSmad. Инъецированные эмбрионы и неинъекционные братья и сестры выращиваются в темноте до 40% эпиболии (~6 hpf). Половина введенных и половина невведенных эмбрионов подвергается воздействию однородного синего света в течение 20 минут. После экспозиции все эмбрионы фиксируют и подвергают иммунофлуоресцентному окрашиванию на pSmad. Повышенные уровни pSmad1/5/9 или pSmad2/3 отражают оптогенетическую активацию BMP или узловой сигнализации, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Оценка световых сигнальных реакций у эмбрионов рыбок данио. Эмбрионы данио-рерио вводили на одноклеточной стадии мРНК, кодирующей bOpto-BMP/Nodal. (А) Эмбрионы либо выращивали в темноте, либо подвергали воздействию однородного синего света, начиная с 1,5 ч после оплодотворения. Фенотипы оценивали через 1 день после оплодотворения (DPF). Показаны репрезентативные фенотипы. Избыточная передача сигналов BMP приводит к вентризации (левая панель), в то время как избыточная передача сигналов узлам вызывает дефекты развития, связанные с дополнительной мезендодермой (правая панель). Масштабная линейка = 500 мкм. (B) Количественная оценка фенотипа. Введенные эмбрионы и неинъекционные братья и сестры выращивались в темноте, начиная с 1,5 hpf (черная лампа). Половина инъекционных и половина невведенных эмбрионов подвергались воздействию однородного синего света (синяя лампа). (C) Эмбрионы с инъекциями и братья и сестры, не получившие инъекции, выращивались в темноте, начиная с 1,5 hpf (черная лампочка). При 40% эпиболии (~6 hpf) половина введенных и половина невведенных эмбрионов подвергались воздействию однородного синего света (синяя лампа). Через 20 мин все эмбрионы фиксировали и подвергали иммунофлуоресцентному окрашиванию на фосфорилированный Smad1/5/9 или Smad2/3. Более высокая интенсивность pSmad указывает на усиление BMP/Nodal сигнализации, соответственно. Масштабная линейка = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Световой короб в сборе. Файл 3D PDF, показывающий 3D-вид всей сборки светового короба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 2: Световой короб в разобранном виде. 3D-файл PDF, показывающий 3D-вид разнесенного светового короба в сборе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 3: Большая легкая прокладка. Файл чертежа САПР (. DWG) для изготовления большой световой прокладки для держателя светодиода с помощью лазерного резака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 4: Маленькая легкая прокладка. Файл чертежа САПР (. DWG) для изготовления небольшой световой прокладки для держателя светодиода с помощью лазерного резака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 5: Акриловая основа платформы. Файл чертежа САПР (. DWG) для изготовления акрилового основания платформы светодиодного держателя с помощью лазерного резака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 6: Акриловая платформа вертикальная. Файл чертежа САПР (. DWG) для изготовления акриловой платформы для светодиодного держателя вертикальной с помощью лазерного резака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 7: Акриловая опора слева. Файл чертежа САПР (. DWG) для изготовления держателя светодиода с акриловой левой опорой с помощью лазерного резака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 8: Акриловая опора справа. Файл чертежа САПР (. DWG) для изготовления акриловой правой опоры светодиодного держателя с помощью лазерного резака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Инъекция мРНК является текущей стратегией доставки bOpto-BMP/Nodal эмбрионам рыбок данио. У этого способа есть несколько недостатков. Во-первых, соответствующее количество мРНК варьируется в зависимости от лаборатории. Используемое количество должно быть достаточным для надежной активации сигнализации при воздействии света, но без непреднамеренной активации в темноте. Хорошей идеей является тестирование нескольких количеств, чтобы найти оптимальные уровни мРНК, и после их установления создать аликвоты мастер-смеси для воспроизводимого введения того же количества мРНК. Во-вторых, неравномерное распределение введенной мРНК может привести к неравномерной активации сигналов. Считается, что инъекция в центр клетки (а не в желток) способствует равномерному распределению мРНК. Наконец, поскольку введенная мРНК со временем деградирует, этот подход может не подходить для экспериментов на более старых эмбрионах. В будущем эти проблемы могут быть решены с помощью трансгенных линий данио-рерио, повсеместно экспрессирующих bOpto-BMP/Nodal с материнским или лекарственно-индуцируемым промотором. Несмотря на то, что работа с потенциально светочувствительными взрослыми рыбками данио-рерио может быть сложной задачей в этом контексте, трансгенные рыбки данио-рерио 61,62 и дрозофилы 22,34,35,63, содержащие оптогенетические инструменты, были успешно разработаны.
Предотвращение непреднамеренной фотоактивации является общей проблемой при использовании оптогенетических инструментов. Для простоты относитесь к инъекционным эмбрионам старше 1,5 hpf как к светочувствительным. Непреднамеренного воздействия света часто можно избежать, просто обернув тарелки или посуду алюминиевой фольгой. Однако для экспериментов, требующих визуального наблюдения за живыми эмбрионами старше 1,5 hpf, можно использовать красные источники света или покрыть белые источники света недорогой гелевой фильтровальной бумагой, блокирующей LOV-димеризирующие длины волн (Таблица материалов).
Описанный здесь световой короб предназначен для конкретных применений, требующих точного контроля над уровнями светового излучения, динамикой и длинами волн (рис. 2). К другим преимуществам этого светового короба относятся равномерное воздействие света, незначительный непреднамеренный нагрев образца, достаточное пространство для нескольких 6-луночных планшетов и долговечные, спектрально хорошо охарактеризованные источники света. Тем не менее, различные стратегии воздействия света могут быть предпочтительными в зависимости от области применения. Многие лаборатории разработали более простые и экономичные системы равномерного воздействия света с меньшей занимаемой площадью, включая облицовку инкубаторов светодиодными лентами, подвешивание светодиодных панелей над образцами или включение светодиодов в крышки чашк для культивирования 32,38,39,40,64,65,66 . Важно отметить, что световой короб, используемый в этом протоколе, не позволяет пользователям самостоятельно регулировать отдельные лунки (в отличие от Bugaj et al.52) или обеспечивать пространственный контроль над освещенностью. Пространственно локализованная оптогенетическая активация была продемонстрирована с помощью bOpto-BMP38 и bOpto-Nodal39 с использованием лазеров в SPIM или конфокальных системах соответственно, а также была реализована со многими другими оптогенетическими стратегиями в различных модельных системах (обсуждается в Rogers and Müller12). Некоторые подходы даже достигают субклеточного пространственного разрешения 29,30,31. Несмотря на то, что реализация пространственно локализованных систем воздействия света выходит за рамки данного протокола, эксперименты по пространственной активации с помощью bOpto-BMP/Nodal теоретически возможны с помощью специализированного оборудования, такого как цифровые микрозеркальные устройства или маскирующие подходы. Читателям рекомендуется изучить обширную литературу по самодельным световым коробам для оптогенетических экспериментов, прежде чем переходить к стратегии воздействия света (см., например, Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar and Khammash 53 и др. на https://www.optobase.org/materials/).
Молекулярно-оптогенетические стратегии часто предлагают более высокую степень пространственно-временного контроля над биологическими процессами по сравнению с историческими подходами, такими как мутанты, эктопическая экспрессия генов, рекомбинантные белки и лекарства. Читатели, заинтересованные в преимуществах оптогенетических подходов, могут ознакомиться с другими опубликованными инструментами, доступными для рыбок данио-рерио и других организмов. К ним относятся инструменты для манипулирования дополнительными сигнальными путями 32,65,67,68, регуляции экспрессии генов 61,64,66,69,70,71, изменения локализации белка 31,72 и активации апоптоза 62. Эти и многие другие инструменты удобно каталогизированы на OptoBase, курируемом веб-ресурсе, посвященном молекулярно-оптогенетическим подходам28. Для тех, кто вдохновлен созданием новых оптогенетических инструментов, ресурс также содержит полезные описания светочувствительных белков, которые использовались в широком спектре стратегий, включая светочувствительные белки, реагирующие на зеленые, красные и ближние инфракрасные длины волн. Мы рады, что научное сообщество осознает весь потенциал молекулярно-оптогенетических подходов.
Авторам нечего раскрывать.
Финансирование этого протокола было предоставлено KWR в рамках Очной программы NICHD (ZIA HD009002-01). Мы благодарим Джеффа Фаррелла (Jeff Farrell) и его лабораторию за их полезные отзывы, Уилла Андерсона (Will Anderson) за отличную техническую поддержку, Лиэнн Ианнуччи (Leanne Iannucci) за стресс-тестирование протокола и измерение освещенности, а также NIH Shared Zebrafish за их усердную работу по поддержанию здоровья рыбок данио.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Building a light box & Light exposure protocol | |||
#8 x 1" Hex Self-drilling Screw | McMaster-Carr | 99663A222 | 1.4.5 |
Digital Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | 1.7 4 |
Incubator (142 liters) | Boekel Scientific | 139400 | 1.3.1 |
Incubator Panel Mount (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Incubator_panel | 1.4.4 |
Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit | CO-Z | SDB0001TA | 1.3.2 |
LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32" thick black silicone | McMaster-Carr | 5812T12 | 1.4.3 1.4.4 |
LED microplate illuminator | Prizmatix | NA | 1.1 1.4.3 |
M3 10mm Cube Standoff | Newark Eletronics | 005.60.533 | 1.4.1 |
M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A156 | 1.4.1 |
M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw | McMaster-Carr | 91801A305 | 1.4.3 |
Memory card thermometer | Fisherbrand | 15-081-111 | 1.9 3.2.1 |
Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW) | ThorLabs | S170C | 1.7 4 |
Red gel filter paper #E106 | Rosco / B&H Foto & Electronics | 110084014805-E106 | 4.2.1 |
Side Brackets (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Side_bracket | 1.4.2 |
Vertical Bracket (1/4" thick cast black acrylic) | Custom part / Piedmont Plastics | Vertical_bracket | 1.4.1 |
Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2" wd 1/4" tk | McMaster-Carr | 8694K12 | 1.8 |
Generating mRNA | |||
EZNA MicroElute Cycle Pure Kit | Omega | D6293-02 | 2.4 |
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns) | Thermo Scientific | K0503 | 2.2 |
Microsample incubator (Hybex) | SciGene | 1057-30-0 | 2 |
Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex) | SciGene | 1057-34-0 | 2 |
Nanodrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | 2.4 |
NotI-HF restriction enzyme | New England Biolabs (NEB) | R3189L | 2.1 |
pCS2-Opto-Alk3 | Addgene | 207614 | 2 |
pCS2-Opto-Alk8 | Addgene | 207615 | 2 |
pCS2-Opto-BMPR2a | Addgene | 207616 | 2 |
RNeasy Mini Kit (250 rxns) | Qiagen | 74106 | 2.3 |
Injecting mRNA | |||
Agarose (UltraPure) | Invitrogen / Thermo Fisher | 16500500 | 3.1.1 |
250 ml glass beakers | Fisherbrand | FB100250 | 3.3.2 |
6-well dishes (case of 50) | Falcon | 08 772 1B | 3.1.6 |
B-8A ball joint | Narishige | B-8A | 3.3 |
Back pressure unit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | BPU | 3.3 |
Foot switch (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | FWS | 3.3 |
GJ-1 magnetic stand | Narishige | GJ-1 | 3.3 |
Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament) | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 3.1.11 |
Glass petri dish bottoms (for dechorionating) | Pyrex | 08-748A | 3.3.2 |
Glass pipettes (5 3/4" with wide tip) | Kimble-Chase | 63A53WT | 3.1.9 |
Injection dish molds | Adaptive Science Tools | tu1 | 3.1.3 |
IP iron plate | Narishige | IP | 3.3 |
M-152 micromanipulator | Narishige | M-152 | 3.3 |
Micro pipette holder kit (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MIMPH-MPIP-Kit | 3.3 |
Micrometers | Meiji Techno America | MA285 | 3.3 |
MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component) | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MPPI-3 | 3.3 |
Needle puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | 3.1.11 |
Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500) | Falcon | 08-757-100D | 3.1.2 |
Pipettor (10 ml, green) | Bel-Art | F37898-0000 | 3.3 |
Pronase | Roche | 11459643001 | 3.3.2 |
Squeeze bottles (500 ml) | Nalgene / Thermo Scientific | 2402-0500 | 3.3 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены