Методы изучения биоэнергетики митохондрий при физиологически значимых концентрациях субстрата в иммунных клетках ограничены. Мы предоставляем подробный протокол, в котором используется флуореспирометрия высокого разрешения для оценки изменений в реакции потенциала митохондриальной мембраны на потребность в энергии в Т-клетках, моноцитах и периферических мононуклеарных клетках человека.
Периферические мононуклеарные клетки (PBMC) демонстрируют устойчивые изменения дыхательной способности митохондрий в ответ на состояние здоровья и болезнь. Хотя эти изменения не всегда отражают то, что происходит в других тканях, таких как скелетные мышцы, эти клетки являются доступным и ценным источником жизнеспособных митохондрий человека. ПМК подвергаются воздействию системных сигналов, которые влияют на их биоэнергетическое состояние. Таким образом, расширение наших инструментов для исследования митохондриального метаболизма в этой популяции прояснит механизмы, связанные с прогрессированием заболевания. Функциональные анализы митохондрий часто ограничиваются использованием дыхательных выходов после максимальных концентраций субстрата, ингибитора и разъединителя для определения полного диапазона дыхательной способности, что может быть недостижимо in vivo. Превращение аденозиндифосфата (АДФ) в аденозинтрифосфат (АТФ) с помощью АТФ-синтазы приводит к снижению потенциала митохондриальной мембраны (мМП) и увеличению потребления кислорода. Чтобы обеспечить более комплексный анализ митохондриальной динамики, в данной статье описывается использование флуореспирометрии высокого разрешения для измерения одновременной реакции потребления кислорода и потенциала митохондриальной мембраны (мМП) на физиологически значимые концентрации АДФ. В этом методе используется метиловый эфир тетраметилродамина (TMRM) для измерения поляризации mMP в ответ на титрование ADP после максимальной гиперполяризации сложными субстратами I и II. Этот метод может быть использован для количественной оценки того, как изменения в состоянии здоровья, такие как старение и метаболические заболевания, влияют на чувствительность митохондриального ответа на потребность в энергии в PBMC, Т-клетках и моноцитах человека.
Способность клетки функционировать и выживать в период физиологического стресса в значительной степени зависит от ее способности удовлетворять энергетическую потребность для восстановления гомеостаза. Спрос на энергию растет в ответ на различные раздражители. Например, увеличение мышечного сокращения во время физических упражнений увеличивает использование АТФ и глюкозы скелетными мышцами, а увеличение синтеза белка после инфекции увеличивает использование АТФ иммунными клетками для производства и пролиферации цитокинов 3,4,5,6. Всплеск потребности в энергии запускает ряд биоэнергетических процессов, направленных на восстановление соотношения АТФ/АДФ. По мере потребления АТФ уровни АДФ повышаются и стимулируют F1F0 АТФ-синтазу (комплекс V), которая требует протонной движущей силы для управления ее механическим вращением и каталитическим превращением АДФ в АТФ в митохондриях7. Протондвижущая сила — это электрохимический градиент, создаваемый накачкой протонов во время переноса электронов от субстратов к кислороду через систему переноса электронов (ETS) внутри внутренней митохондриальной мембраны. Результирующая разница между концентрацией протонов (дельта pH) и электрическим потенциалом (мембранным потенциалом) создает протонную движущую силу, которая стимулирует синтез АТФ и потребление кислорода в ответ на потребность в энергии, снижающую отношение АТФ/АДФ или повышающую уровень АДФ. Сродство митохондрий к АДФ может быть определено путем расчета Km или EC50 АДФ-стимулированного дыхания изолированных митохондрий или проникнутых клеток 8,9. Этот метод показал, что проникающие мышечные волокна пожилых людей требуют большей концентрации АДФ для стимуляции 50% их максимальной способности к окислительному фосфорилированию, чем у более молодых людей9. Аналогичным образом, стареющие скелетные мышцы мышей требуют большего количества АДФ, чтобы снизить выработку митохондриальных активных форм кислорода (АФК)10,11. Кроме того, чувствительность к АДФ снижается в пермеабилизированных мышечных волокнах мышей с ожирением, вызванным диетой, по сравнению с контрольной группой и усиливается в присутствии инсулина и после потребления нитратов12,13. Таким образом, способность митохондрий реагировать на потребность в энергии варьируется в зависимости от различных физиологических условий, но ранее это не изучалось в контексте иммунных клеток.
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обычно используются для исследования клеточной биоэнергетики у людей 14,15,16,17,18,19,20. В значительной степени это связано с тем, что клетки легко получить из некоагулированных образцов крови в клинических исследованиях, реакцией клеток на метаболические возмущения и методами, разработанными различными группами для исследования митохондриального метаболизма с использованием ингибиторов и разъединителей для определения максимальной и минимальной способности митохондриального дыхания21,22. Эти методы привели к пониманию роли биоэнергетики в старении, метаболических заболеваниях и иммунной функции 14,20,23,24. Митохондриальная дыхательная способность часто снижается в скелетных мышцах и PBMC в условиях сердечной недостаточности18,25. Биоэнергетика PBMC также коррелирует с кардиометаболическими факторами риска у здоровых взрослых17 и реагирует на такие методы лечения, как никотинамид рибозид18. PBMC включают нейтрофилы, лимфоциты (В-клетки и Т-клетки), моноциты, естественные киллеры и дендритные клетки, которые вносят свой вклад в митохондриальную емкость PBMC 26,27,28. Кроме того, клеточная биоэнергетика играет решающую роль в активации, пролиферации и обновлении иммунных клеток23. Однако ограничением этих методов является то, что клетки не функционируют в физиологическом диапазоне субстратов. Поэтому требуются дополнительные методы для изучения функции митохондрий в концентрациях субстрата, которые более релевантны тому, что клетки испытывают in vivo.
Потенциал митохондриальной мембраны (мМП) является основным компонентом протондвижущей силы и необходим для различных митохондриальных процессов, выходящих за рамки производства АТФ, таких как регуляция дыхательного потока, производство активных форм кислорода, импорт белков и ионов, аутофагия и апоптоз. mMP можно оценить с помощью электрохимических зондов или флуоресцентных красителей, чувствительных к изменениям поляризации мембраны, таких как JC-1, Rhod123, DiOC6, тетраметилродамин (TMRE) или метиловый эфир (TMRM) и сафранин. Последние два являются липофильными катионными красителями, которые были успешно использованы в флуореспирометрии высокого разрешения тканевых гомогенатов, изолированных митохондрий и пермеабилизированных тканей 11,29,30,31,32,33. В этом методе TMRM используется в режиме гашения, когда клетки подвергаются воздействию высокой концентрации TMRM, которая накапливается в митохондриальном матриксе при поляризации (высокая mMP и протондвижущая сила), что приводит к гашению цитозольной флуоресценции TMRM. Когда митохондрии деполяризуются в ответ на АДФ или развязки, краситель высвобождается из матрицы, увеличивая флуоресцентный сигнал TMRM34,35. Целью этого метода является одновременное измерение изменений митохондриального дыхания и мМП в ответ на титрование АДФ в PBMC человеческого происхождения, циркулирующих моноцитах и Т-клетках, а также он может быть применен к Т-клеткам селезенки мышей.
Сбор образцов крови для разработки данных и методов, представленных в настоящем документе, был одобрен Советом по внутреннему контролю Вашингтонского университета. Репрезентативные результаты также включают данные о самцах мышей C57BL/6J (5-7 месяцев), приобретенных в Jackson Laboratories. Все процедуры с животными были одобрены Управлением по защите животных Вашингтонского университета. Обзор протокола показан на рисунке 1. Приготовление реагентов для этого протокола можно найти в Дополнительном файле 1.
Рисунок 1: Обзор протокола. Рабочий процесс с использованием флуореспирометрии высокого разрешения для оценки изменений потенциала митохондриальной мембраны в изолированных моноцитах (CD14+) и Т-клетках (CD3+) из свежих образцов крови человека. Сокращения: TMRM, метиловый эфир тетраметилродамина; SUIT, титрование субстрата-разъединителя-ингибитора; АДФ, аденозиндифосфат; Дигтонин, дигитонин; Mal, малат; пир, пируват; Глют, глутамат; D1-10, 10 последовательных титрований ADP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
1. Отделение охристой шерсти от цельной крови
ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение клеток модифицировано из Kramer et al.27.
2. Магнитная сепарация CD14+ и CD3+ клеток
3. Флуореспирометрия высокого разрешения - калибровка кислорода и флуоресценции TMRM
Примечание: Этот метод был адаптирован из предыдущей работы, проведенной на пермеабилизированных волокнах Pharaoh et al.11. Высокая, неингибиторная концентрация TMRM используется для режима гашения, где соотношение mMP и концентрации TMRM в матрице инвертировано. Таким образом, снижение мМП приводит к высвобождению красителя TMRM из матрицы и увеличению флуоресценции32.
4. Протокол титрования субстрата-разъединителя-ингибитора (SUIT)
ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите холостые эксперименты, в которых 20 мкл Mir05 вводится в камеру вместо 20 мкл клеточной суспензии, так как сигнал TMRM будет изменяться в ответ только на инъекции (обсуждается в репрезентативных результатах). Дайте сигналу потока кислорода стабилизироваться (около 2-3 минут) перед следующей инъекцией для экспериментов с холостыми патронами и образцами. Следующий протокол титрования и ожидаемые наблюдения приведены в таблице 1.
5. Расчет потенциала митохондриальной мембраны и анализ
Рисунок 2: Расчет потенциала митохондриальной мембраны (мМП) и чувствительности АДФ по флуоресценции TMRM. Этапы расчета потенциала митохондриальной мембраны (мМП) и чувствительности АДФ по результатам измерений флуоресценции TMRM методом флуоресценции высокого разрешения одного образца Т-клеток (n = 1). Шаг 1: Флуоресценция TMRM измеряется в чистых образцах так же, как и в биологическом образце. Шаг 2: Определите соотношение в сигнале TMRM при каждом титровании относительно сигнала перед выборкой для каждого эксперимента с холостым патроном. Рассчитайте среднее значение для каждого титрования всех пустых экспериментов. Шаг 3: Рассчитайте фон для каждого эксперимента с образцом, умножив флуоресценцию «предварительного образца» на среднее отношение фона для каждого титрования. Шаг 4: Рассчитайте разницу между фоновой и образцом флуоресценции TMRM для каждого титрования, чтобы выразить данные в виде мМП или митохондриального поглощения TMRM. Шаг 5: Скорректируйте mMP так, чтобы полное разъединение с FCCP отражало ноль mMP. Шаг 6: Выполните нелинейную регрессию для построения графика изменений в мМС с увеличением концентрации АДФ. Измерения проводились в камерах объемом 0,5 мл, одна из которых содержала 5 миллионов Т-клеток здорового добровольца. Усредненные данные выражаются как среднее значение ± SEM. Отдельные точки данных одной реплики выражаются без полос погрешностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Чтобы проиллюстрировать различия в оптимальной концентрации клеток для анализа, 5 миллионов Т-клеток были загружены в одну камеру объемом 0,5 мл (10 миллионов клеток/мл), а 1,25 миллиона клеток были загружены в другую камеру (2,5 миллиона клеток/мл), содержащую 1 μМ TMRM (рис. 3A-G). Также были включены три пустых эксперимента для расчета фона TMRM. Мы обнаружили, что более высокая концентрация Т-клеток приводит к более заметному изменению флуоресценции TMRM относительно фона (рис. 3B, D). Кроме того, более высокая концентрация клеток позволила нам обнаружить ожидаемое увеличение потребления кислорода и одновременное истощение mMP в ответ на добавление FCCP (рис. 3E, F). Использование низкой концентрации клеток дало слабое изменение флуоресценции, которое шло параллельно фону. Поскольку при расчете мМП из сигнала вычитается фон, низкая концентрация клеток не позволяет определить изменения мМП в ответ на подложки и размыкатели. В дополнение к использованию более высоких концентраций клеток в этом анализе, мы рекомендуем поддерживать постоянную концентрацию клеток для каждого типа клеток между экспериментами.
Чтобы проверить влияние АТФ-синтазы на диссипацию mMP при титровании АДФ, мы провели параллельные эксперименты на PBMC и Т-клетках, в которых одна камера получала олигомицин перед титрованием ADP (рис. 4). Мы не обнаружили диссипации mMP в ответ на АДФ в клетках, обработанных олигомицином, что позволяет предположить, что постепенное снижение mMP при АДФ является результатом потока протонов через АТФ-синтазу (рис. 4A-F). Мы также сравнили чувствительность АДФ между Т-клетками и PBMC одного и того же участника и обнаружили, что чувствительность АДФ ниже (выше EC50) во фракции Т-клеток (рис. 4G, H).
Мы провели серию холостых экспериментов для определения влияния времени или протокола SUIT на флуоресценцию TMRM. Мы обнаружили, что сигнал TMRM в экспериментах с холостыми патронами в основном зависит от титрования SUIT (рис. 5A), а не от времени титрования (рис. 5B).
Мы сравнили вызванные АДФ изменения скорости потребления кислорода (OCR) и мМП в Т-клетках и моноцитах у 11 здоровых добровольцев, проживающих в общественных местах (рис. 6A-H). Подобно ранее опубликованным экспериментам с использованием внеклеточного потока и ферментативных анализов, моноциты продемонстрировали большую митохондриальную дыхательную способность, чем лимфоциты 26,27 (рис. 6A,H). Тем не менее, мы не обнаружили типичного увеличения зависимости «доза-реакция» при ОКР при АДФ ни в одном из типов клеток (Рисунок 6C, D), в отличие от того, что показывает этот метод при использовании высокометаболических тканей, таких как печень мыши (Рисунок 7A-H). С другой стороны, использование TMRM позволило нам обнаружить постепенное снижение mMP при АДФ в иммунных клетках человека (рисунок 6E-G) и в Т-клетках селезенки мышей (рисунок 7E-H). Несмотря на то, что мы не сравнивали Т-клетки человека и мыши напрямую с использованием одного и того же протокола титрования, мы обнаружили, что IC50 Т-клеток мыши был ниже в 10 раз по сравнению с циркулирующими Т-клетками человека.
Рисунок 3: Эксперименты с флуореспирометрией высокого разрешения. (A-D) Следы экспериментов с флуореспирометрией высокого разрешения с использованием концентраций Т-клеток 10 миллионов клеток/мл и 2,5 миллионов клеток/мл в камерах 0,5 мл. (А) 10 миллионов клеток/мл в камерах объемом 0,5 мл. (C) 2,5 миллиона клеток/мл в камерах объемом 0,5 мл. Поток кислорода (пмоль/с/мл) отображается на верхней панели (красный цвет), а откалиброванный сигнал TMRM — на нижней панели (черный). Изменения TMRM на протяжении всего SUIT для образца и его расчетный фон были построены для камер, содержащих (B) 10 млн клеток/мл и (D) 2,5 млн клеток/мл. (E) Для каждой концентрации клеток рассчитывали поток кислорода (пмоль/с/миллион клеток) и (F) потенциал митохондриальной мембраны. (G) Кривая чувствительности ADP была построена и подогнана к модели нелинейной регрессии (сплошные линии). Сокращения: mMP — потенциал митохондриальной мембраны; TMRM, метиловый эфир тетраметилродамина; SUIT, титрование субстрата-разъединителя-ингибитора; АДФ, аденозиндифосфат; Дигтонин, дигитонин; Mal, малат; пир, пируват; Глют, глутамат; D1-11, 11 последовательных титрований ADP; U, развязывающее FCCP 0,5 и 1,0 мкМ; АМА, антимицин А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: АТФ-синтаза приводит к вызванному АДФ снижению мембранного потенциала в Т-клетках и PBMC. (A-H) Описанный здесь протокол был протестирован на PBMC и Т-клетках. В две камеры O2K были введены PBMC, а в две камеры еще одного O2K были введены Т-клетки от того же участника. После введения субстратов малата, пирувата и глутамата во все камеры в одну камеру PBMCs и Т-клеток получался олигомицин. Олигомицин предотвращал любое вызванное АДФ повышение дыхания в (A) PBMC и (D) T-клетках или снижение потенциала митохондриальных мембран в PBMC (B,C) и (E,F) Т-клетках. (Г,Н) Чувствительность к АДФ была выше в PBMC по сравнению с Т-клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Эксперименты с бланками показывают изменение флуоресценции TMRM в ответ на время и титрование субстратов, развязчиков и ингибиторов (SUIT). (A) Изменение флуоресценции TMRM в ответ на титрование. (B) Изменение флуоресценции TMRM в зависимости от времени. Эксперименты проводились в камерах объемом 0,5 мл, заполненных препаратом Мир05, содержащим 1 мкМ TMRM. В одной камере не проводилось никаких титрований SUIT (инъекций); две камеры в двух разных инструментах получили стандартный протокол костюма (стандартный впрыск); одна камера получала те же титрования SUIT, но с задержкой между каждым впрыском (отложенный впрыск). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6: Различия в чувствительности АДФ между Т-клетками и моноцитами с использованием OCR и mMP. (A) След эксперимента с флуореспирометрией высокого разрешения из образца моноцитов и Т-клеток субъекта. (В) Потребление кислорода в моноцитах (n=11) и Т-клетках (n=13) из крови здоровых добровольцев. (К,Г) Нелинейная регрессионная аппроксимация построенного на графике повышения дыхания с титрованием ADP для расчета EC50. (E) Одновременное измерение потенциала митохондриальной мембраны. (Ф,Г) Нелинейная регрессионная аппроксимация графика снижения потенциала митохондриальной мембраны с титрованием АДФ для расчета IC50. (H) Параметры дыхательной способности моноцитов и Т-клеток. Данные выражаются как среднее значение ± SEM для линейных графиков и среднее значение ± SD для столбчатых диаграмм. Статистически значимые различия после t-критерия выражаются в виде *p < 0,05. **p < 0,01, а ****p < за 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7: Сравнение ответа АДФ на дыхание и потенциал митохондриальной мембраны (мМП) в пермеабилизированных Т-клетках селезенки и печени мышей. (A-D) Ответ на дыхание в пермеабилизированных Т-клетках селезенки мыши и печени. (Э-Х) Реакция в мМП в пермеабилизированных Т-клетках селезенки мыши и печени. Свежая печень и селезенка были препарированы у трех мышей после вывиха шейки матки. Т-клетки селезенки Pan выделяли с помощью разделения магнитных шариков, конъюгированного антителами. Оба образца подвергались одинаковому протоколу SUIT в присутствии 1 мкМ TMRM. (И,Дж) Сравнение EC50, рассчитанного по увеличению потребления кислорода (OCR), и IC50 по уменьшению mMP в ответ на АДФ. N = 3 на группу. Данные выражены как среднее значение ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Пример протокола SUIT для оценки потенциала митохондриальной мембраны в свежевыделенных Т-клетках и моноцитах с использованием камер объемом 0,5 мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Рекомендуемое титрование АДФ для камеры объемом 0,5 мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 3: Расчет среднего коэффициента фона с использованием пяти независимых тестовых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 4: Расчет потенциала митохондриальной мембраны (мМП) по результатам эксперимента с образцом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Дополнительный рисунок 1: Влияние Mir05 и ДМСО на митохондриальное дыхание и мембранный потенциал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 1: Приготовление реагента и протокол выделения Т-клеток из селезенки мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
В этом протоколе используется флуореспирометрия высокого разрешения для измерения чувствительности митохондриального ответа на потребность в энергии путем измерения диссипации mMP в ответ на повышение уровня АДФ в PBMC, моноцитах и Т-клетках. Это делается путем добавления сложных субстратов I и II для максимизации потенциала митохондриальной мембраны и титрования АДФ для постепенной стимуляции АТФ-синтазы для использования протонного градиента для генерации АТФ.
Важнейшие шаги в протоколе включают установку коэффициента усиления и интенсивности флуорофора на 1000 и обеспечение получения флуоресцентного сигнала TMRM во время титрования TMRM. Поскольку флуоресценция TMRM снижается после каждого титрования (ограничение этого метода), крайне важно проводить фоновые эксперименты с использованием пустых образцов. Мы также обнаружили, что ДМСО оказывает ингибиторное действие на митохондриальное дыхание и мембранный потенциал, поэтому рекомендуем разбавлять рабочий раствор TMRM в Mir05 (дополнительный рисунок 1).
Некоторые модификации, которые могут быть использованы при использовании этого протокола, включают регулировку концентрации клеток и использование стандартной камеры объемом 2 мл. Тем не менее, камера объемом 0,5 мл предпочтительна для Т-клеток и моноцитов из-за высокой концентрации клеток, необходимой для оптимального ответа на мембранный потенциал и поток кислорода. Более низкая концентрация клеток может быть оптимальной при тестировании клеток с большей дыхательной способностью, таких как макрофаги.
Дополнительные ограничения представленного здесь метода включают потребность не менее чем в 5 миллионах Т-клеток и 2,5 миллионах моноцитов. Мы часто можем получить достаточное количество клеток из ~20 мл крови здоровых участников, но эти цифры могут варьироваться в зависимости от состояния здоровья, возрастаи пола. Кроме того, как и в большинстве методов оценки митохондриальной емкости, клетки должны быть только что изолированы. Тем не менее, этот метод может быть опробован в криоконсервированных клетках в будущем. По сравнению с выходом из крови человека, выход Т-клеток из селезенки здоровых мышей достаточно высок для проведения данного анализа.
Циркулирующие Т-клетки, особенно долгоживущие клетки памяти (TM) и регуляторные (Treg), полагаются на окислительное фосфорилирование для получения энергии. В то время как их потребность в энергии и потребление кислорода низки (например, по сравнению с мышцами в состоянии покоя), их выживание имеет важное значение для эффективного иммунного ответа на повторное заражение и рак 38,39,40. Снижение окислительного фосфорилирования Т-клеток приводит к нарушению пролиферативной способности и способствует истощению и старению Т-клеток 5,41. Кроме того, митохондриальная гиперполяризация способствует устойчивой продукции цитокинов (IL-4 и IL-21) эффекторными CD4 Т-клетками во время активации42. После инфицирования потребность в энергии для активации и пролиферации иммунных клеток может достигать 25-30%от основного метаболизма. Таким образом, иммунные клетки функционируют в широком и экстремальном диапазоне энергетических потребностей, и этот протокол может проверить митохондриальные реакции в этом диапазоне.
Хроническое воспаление является общим признаком ожирения, диабета и старения. Нерегулируемые уровни циркулирующих гормонов, липидов и глюкозы оказывают системное воздействие и, таким образом, могут влиять на то, как митохондрии реагируют на энергетическую задачу. Здесь мы представили метод оценки чувствительности митохондриального АДФ в циркулирующих PBMC. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, как чувствительность к АДФ может модулироваться при метаболических заболеваниях и как это влияет на состояние здоровья.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Мы хотели бы поблагодарить добрых волонтеров, которые сдали кровь для этого проекта. Мы также выражаем нашу искреннюю признательность доктору Эллен Шур и ее команде за предоставление нам дополнительных образцов из их исследования. Мы также хотели бы поблагодарить Эндрю Кирша за рецензирование рукописи и редактирование ее для удобочитаемости. Эта работа была поддержана следующими источниками финансирования: P01AG001751, R01AG078279, P30AR074990, P30DK035816, P30DK017047, R01DK089036, K01HL154761, T32AG066574.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenosine Diphosphate | Sigma-Aldrich | A5285 | Fluorespirometry |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Fluorespirometry |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | Mir05 buffer |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | Cell isolation |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | Fluorespirometry |
Cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Cell isolation |
CD3 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | Cell isolation |
DatLab | Oroboros | Version 8 | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Fluorespirometry |
D-Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Mir05 buffer |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | Mir05 buffer |
Filter Set AmR | Oroboros | 44321-01 | |
HBSS (10x) | Gibco | 12060-040 | |
HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7523 | Mir05 buffer |
Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell isolation |
K2EDTA blood collection tubes | BD Vacutainer | 366643 | Cell isolation |
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | Mir05 buffer |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | Fluorespirometry |
L-Malic Acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Fluorespirometry |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Cell isolation |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | Mir05 buffer |
Multi-MACS stand and MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | Cell isolation |
O2k-Fluo Smart-Module | Oroboros | 12100-03 | |
O2k-FluoRespirometer series J | Oroboros | 10201-03 | |
O2k-sV-Module (0.5 chamber) | Oroboros | 11200-01 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 04876 | Fluorespirometry |
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi | 130095130 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | Mir05 buffer |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | Mir05 buffer |
Prism | GraphPad | Version 10 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Fluorespirometry |
RPMI Buffer | Corning | 17-105-CV | Cell isolation |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Fluorespirometry |
Succinate disodium salt | Sigma-Aldrich | S2378 | Fluorespirometry |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Mir05 buffer |
Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite | Sigma-Aldrich | T5428 | Fluorespirometry |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены