В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Методы изучения биоэнергетики митохондрий при физиологически значимых концентрациях субстрата в иммунных клетках ограничены. Мы предоставляем подробный протокол, в котором используется флуореспирометрия высокого разрешения для оценки изменений в реакции потенциала митохондриальной мембраны на потребность в энергии в Т-клетках, моноцитах и периферических мононуклеарных клетках человека.

Аннотация

Периферические мононуклеарные клетки (PBMC) демонстрируют устойчивые изменения дыхательной способности митохондрий в ответ на состояние здоровья и болезнь. Хотя эти изменения не всегда отражают то, что происходит в других тканях, таких как скелетные мышцы, эти клетки являются доступным и ценным источником жизнеспособных митохондрий человека. ПМК подвергаются воздействию системных сигналов, которые влияют на их биоэнергетическое состояние. Таким образом, расширение наших инструментов для исследования митохондриального метаболизма в этой популяции прояснит механизмы, связанные с прогрессированием заболевания. Функциональные анализы митохондрий часто ограничиваются использованием дыхательных выходов после максимальных концентраций субстрата, ингибитора и разъединителя для определения полного диапазона дыхательной способности, что может быть недостижимо in vivo. Превращение аденозиндифосфата (АДФ) в аденозинтрифосфат (АТФ) с помощью АТФ-синтазы приводит к снижению потенциала митохондриальной мембраны (мМП) и увеличению потребления кислорода. Чтобы обеспечить более комплексный анализ митохондриальной динамики, в данной статье описывается использование флуореспирометрии высокого разрешения для измерения одновременной реакции потребления кислорода и потенциала митохондриальной мембраны (мМП) на физиологически значимые концентрации АДФ. В этом методе используется метиловый эфир тетраметилродамина (TMRM) для измерения поляризации mMP в ответ на титрование ADP после максимальной гиперполяризации сложными субстратами I и II. Этот метод может быть использован для количественной оценки того, как изменения в состоянии здоровья, такие как старение и метаболические заболевания, влияют на чувствительность митохондриального ответа на потребность в энергии в PBMC, Т-клетках и моноцитах человека.

Введение

Способность клетки функционировать и выживать в период физиологического стресса в значительной степени зависит от ее способности удовлетворять энергетическую потребность для восстановления гомеостаза. Спрос на энергию растет в ответ на различные раздражители. Например, увеличение мышечного сокращения во время физических упражнений увеличивает использование АТФ и глюкозы скелетными мышцами, а увеличение синтеза белка после инфекции увеличивает использование АТФ иммунными клетками для производства и пролиферации цитокинов 3,4,5,6. Всплеск потребности в энергии запускает ряд биоэнергетических процессов, направленных на восстановление соотношения АТФ/АДФ. По мере потребления АТФ уровни АДФ повышаются и стимулируют F1F0 АТФ-синтазу (комплекс V), которая требует протонной движущей силы для управления ее механическим вращением и каталитическим превращением АДФ в АТФ в митохондриях7. Протондвижущая сила — это электрохимический градиент, создаваемый накачкой протонов во время переноса электронов от субстратов к кислороду через систему переноса электронов (ETS) внутри внутренней митохондриальной мембраны. Результирующая разница между концентрацией протонов (дельта pH) и электрическим потенциалом (мембранным потенциалом) создает протонную движущую силу, которая стимулирует синтез АТФ и потребление кислорода в ответ на потребность в энергии, снижающую отношение АТФ/АДФ или повышающую уровень АДФ. Сродство митохондрий к АДФ может быть определено путем расчета Km или EC50 АДФ-стимулированного дыхания изолированных митохондрий или проникнутых клеток 8,9. Этот метод показал, что проникающие мышечные волокна пожилых людей требуют большей концентрации АДФ для стимуляции 50% их максимальной способности к окислительному фосфорилированию, чем у более молодых людей9. Аналогичным образом, стареющие скелетные мышцы мышей требуют большего количества АДФ, чтобы снизить выработку митохондриальных активных форм кислорода (АФК)10,11. Кроме того, чувствительность к АДФ снижается в пермеабилизированных мышечных волокнах мышей с ожирением, вызванным диетой, по сравнению с контрольной группой и усиливается в присутствии инсулина и после потребления нитратов12,13. Таким образом, способность митохондрий реагировать на потребность в энергии варьируется в зависимости от различных физиологических условий, но ранее это не изучалось в контексте иммунных клеток.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обычно используются для исследования клеточной биоэнергетики у людей 14,15,16,17,18,19,20. В значительной степени это связано с тем, что клетки легко получить из некоагулированных образцов крови в клинических исследованиях, реакцией клеток на метаболические возмущения и методами, разработанными различными группами для исследования митохондриального метаболизма с использованием ингибиторов и разъединителей для определения максимальной и минимальной способности митохондриального дыхания21,22. Эти методы привели к пониманию роли биоэнергетики в старении, метаболических заболеваниях и иммунной функции 14,20,23,24. Митохондриальная дыхательная способность часто снижается в скелетных мышцах и PBMC в условиях сердечной недостаточности18,25. Биоэнергетика PBMC также коррелирует с кардиометаболическими факторами риска у здоровых взрослых17 и реагирует на такие методы лечения, как никотинамид рибозид18. PBMC включают нейтрофилы, лимфоциты (В-клетки и Т-клетки), моноциты, естественные киллеры и дендритные клетки, которые вносят свой вклад в митохондриальную емкость PBMC 26,27,28. Кроме того, клеточная биоэнергетика играет решающую роль в активации, пролиферации и обновлении иммунных клеток23. Однако ограничением этих методов является то, что клетки не функционируют в физиологическом диапазоне субстратов. Поэтому требуются дополнительные методы для изучения функции митохондрий в концентрациях субстрата, которые более релевантны тому, что клетки испытывают in vivo.

Потенциал митохондриальной мембраны (мМП) является основным компонентом протондвижущей силы и необходим для различных митохондриальных процессов, выходящих за рамки производства АТФ, таких как регуляция дыхательного потока, производство активных форм кислорода, импорт белков и ионов, аутофагия и апоптоз. mMP можно оценить с помощью электрохимических зондов или флуоресцентных красителей, чувствительных к изменениям поляризации мембраны, таких как JC-1, Rhod123, DiOC6, тетраметилродамин (TMRE) или метиловый эфир (TMRM) и сафранин. Последние два являются липофильными катионными красителями, которые были успешно использованы в флуореспирометрии высокого разрешения тканевых гомогенатов, изолированных митохондрий и пермеабилизированных тканей 11,29,30,31,32,33. В этом методе TMRM используется в режиме гашения, когда клетки подвергаются воздействию высокой концентрации TMRM, которая накапливается в митохондриальном матриксе при поляризации (высокая mMP и протондвижущая сила), что приводит к гашению цитозольной флуоресценции TMRM. Когда митохондрии деполяризуются в ответ на АДФ или развязки, краситель высвобождается из матрицы, увеличивая флуоресцентный сигнал TMRM34,35. Целью этого метода является одновременное измерение изменений митохондриального дыхания и мМП в ответ на титрование АДФ в PBMC человеческого происхождения, циркулирующих моноцитах и Т-клетках, а также он может быть применен к Т-клеткам селезенки мышей.

протокол

Сбор образцов крови для разработки данных и методов, представленных в настоящем документе, был одобрен Советом по внутреннему контролю Вашингтонского университета. Репрезентативные результаты также включают данные о самцах мышей C57BL/6J (5-7 месяцев), приобретенных в Jackson Laboratories. Все процедуры с животными были одобрены Управлением по защите животных Вашингтонского университета. Обзор протокола показан на рисунке 1. Приготовление реагентов для этого протокола можно найти в Дополнительном файле 1.

figure-protocol-654
Рисунок 1: Обзор протокола. Рабочий процесс с использованием флуореспирометрии высокого разрешения для оценки изменений потенциала митохондриальной мембраны в изолированных моноцитах (CD14+) и Т-клетках (CD3+) из свежих образцов крови человека. Сокращения: TMRM, метиловый эфир тетраметилродамина; SUIT, титрование субстрата-разъединителя-ингибитора; АДФ, аденозиндифосфат; Дигтонин, дигитонин; Mal, малат; пир, пируват; Глют, глутамат; D1-10, 10 последовательных титрований ADP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Отделение охристой шерсти от цельной крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение клеток модифицировано из Kramer et al.27.

  1. Дайте RPMI, градиенту плотности и центрифуге достичь комнатной температуры. Перед началом работы простерилизуйте шкаф биобезопасности и материалы.
  2. Соберите венозную кровь в три пробирки по 10 мл K2EDTA. Переверните трубки не менее 3 раз.
  3. Центрифугируйте пробирки при давлении 500 x g в течение 10 мин (22 °C, 9 ускорений [acc], 2 замедления [dec]).
  4. Удалите 1 мл плазмы из каждой пробирки и храните при температуре -80 °C для будущих анализов.
  5. Перенесите плазму и половину слоя эритроцитов из каждой пробирки в одну коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте RPMI до отметки 40 мл. Переверните не менее 3 раз.
  6. Медленно нанесите 10 мл плазменного раствора в четыре конические пробирки по 15 мл, содержащие 3 мл градиента плотности.
  7. Центрифуга при 700 x g в течение 30 мин (22 °C, 5 acc, 2 dec).
  8. Соберите всю плазму и охристую оболочку, содержащую периферические мононуклеарные клетки (PBMC), не разрушая эритроциты.
  9. Центрифугируйте при 500 x g в течение 10 минут (22 °C, 5 acc, 5 dec) и отаскайте надосадочную жидкость.
  10. Промойте гранулу PBMC 1x-2x, повторно взвесив ее в 10 мл RPMI и центрифугируя при 500 x g в течение 10 минут (22 °C, 5 acc, 5 dec).

2. Магнитная сепарация CD14+ и CD3+ клеток

  1. Поместите колонку в магнитное поле магнитного сепаратора (см. Таблицу материалов). Промойте колонку 3 мл РП-5.
  2. Ресуспендировать гранулу PBMC в 80 мкл RP-5 и 20 мкл микрогранул анти-CD14 (см. Таблицу материалов). Выдерживать в течение 15 минут при температуре 4 °C.
  3. Повторно суспензируйте ячейки 1 мл РП-5 и загрузите суспензию на колонну. Соберите немаркированные клетки, которые протекают в коническую трубку объемом 15 мл с надписью «Flow-through 1». Дождитесь, пока вся клеточная суспензия пройдет через колонку, затем продолжайте промывание 3 мл РП-5 3х, собирая весь проточный.
  4. Осторожно извлеките колонку из магнитного поля и поместите ее на новую коническую трубку объемом 15 мл. Добавьте 5 мл RP-5 и сразу же с помощью поршня продуйте содержимое колонки в сборную пробирку с маркировкой «CD14+».
  5. Центрифугу "Flow-through 1" при 500 x g в течение 10 мин (22 °C, 5 acc, 5 dec) и аспирируйте надосадочную жидкость.
  6. Используя клетки из Flow-through 1, повторите шаги 2.2-2.5 с использованием анти-CD3 микрогранул (см. Таблицу материалов) для выделения Т-клеток.
  7. Центрифужные пробирки, содержащие Т-клетки (CD3+) и моноциты (CD14+) в дозе 300 x g в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл РП-5.
  8. Определяют концентрацию клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
    Примечание: Клетки можно подсчитать, добавив в гемоцитометр 10 мкл клеточного разведения 1:10 или 1:20. Можно обратиться к ранее опубликованным протоколам подсчета клеток с помощью гемоцитометра36.
  9. Пипетка 2,5 миллиона моноцитов или 5 миллионов Т-клеток в новую центрифужную пробирку. Центрифугируйте в течение 30 с при 2000 x g, аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в MiR05 до общего объема 20 мкл и конечной концентрации 125 миллионов моноцитов или 250 миллионов Т-клеток на мл.
    Примечание: Окончательная концентрация была выбрана для введения 2,5 миллионов моноцитов или 5 миллионов Т-клеток в объеме 20 μл. Мышиные Т-клетки, выделенные из селезенки, также были протестированы с использованием этого метода. Процедура приведена в Дополнительном файле 1.

3. Флуореспирометрия высокого разрешения - калибровка кислорода и флуоресценции TMRM

Примечание: Этот метод был адаптирован из предыдущей работы, проведенной на пермеабилизированных волокнах Pharaoh et al.11. Высокая, неингибиторная концентрация TMRM используется для режима гашения, где соотношение mMP и концентрации TMRM в матрице инвертировано. Таким образом, снижение мМП приводит к высвобождению красителя TMRM из матрицы и увеличению флуоресценции32.

  1. Установите в респирометр О2К камеры объемом 0,5 мл в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов). Включите прибор и подключите его к программному обеспечению, предоставленному производителем для сбора данных.
  2. Отрегулируйте температуру до 37 °C и скорость перемешивания до 750 об/мин.
  3. Промойте камеры дистиллированной водой 3 раза. Замените воду 0,54 мл Mir05, полностью закройте пробки и удалите излишки буфера с помощью встроенной всасывающей системы (ISS). Поднимите пробки, чтобы кислород в помещении уравновесился с кислородом в камере, с помощью ограничителя-распорки.
  4. Как только поток кислорода стабилизируется, выполните калибровку кислорода воздуха (R1) в соответствии с инструкциями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для стабилизации потока кислорода может потребоваться >30 минут. Датчики кислорода требуют определения нулевой точки кислорода (R0) и фонового потока кислорода от 50-200 мкМ в отдельных экспериментах с использованием титрования дитионита. Конкретные методы можно найти в руководстве производителя.
  5. Запечатайте камеру, закрыв пробки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от экспериментов с использованием пермеабилизированных волокон, камеры не требуют гипероксигенации для PBMC. Герметизация камеры после калибровки R1 обеспечивает достаточное количество кислорода для эксперимента. Уровень кислорода должен поддерживаться в пределах 50-250 μМ. Если концентрация кислорода падает ниже порогового значения, камеру можно частично открыть, чтобы кислород в камере мог уравновеситься с кислородом воздуха в помещении.
  6. Калибровка TMRM
    1. Используйте зеленые светодиодные флуосенсоры (например, 525 нм) с комплектом фильтров AmR (см. Таблицу материалов). Установите усиление флуориметра на 1000 и интенсивность на 1000. Включите флуодатчики и начните запись базового уровня.
    2. Введите 2,5 мкл 0,05 мМ TMRM и дайте сигналу стабилизироваться (~2 мин) перед следующей инъекцией 2,5 мкл до тех пор, пока не будет выполнено в общей сложности 4 инъекции для общей концентрации TMRM 1 мкМ TMRM в камере. Используйте шприц Гамильтона для всех инъекций.
    3. Откалибруйте флуоресцентный датчик, выбрав флуоресцентный сигнал (напряжение) для каждой инжекции, представляющий 0, 0,25, 0,5, 0,75 и 1,0 мкМ TMRM для пятиточечной калибровки.

4. Протокол титрования субстрата-разъединителя-ингибитора (SUIT)

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите холостые эксперименты, в которых 20 мкл Mir05 вводится в камеру вместо 20 мкл клеточной суспензии, так как сигнал TMRM будет изменяться в ответ только на инъекции (обсуждается в репрезентативных результатах). Дайте сигналу потока кислорода стабилизироваться (около 2-3 минут) перед следующей инъекцией для экспериментов с холостыми патронами и образцами. Следующий протокол титрования и ожидаемые наблюдения приведены в таблице 1.

  1. Когда поток кислорода стабилизируется, выберите и пометьте поток кислорода и сигнал TMRM «pre-cell».
  2. Введите клеточную суспензию, содержащую либо 5 миллионов Т-клеток, либо 2,5 миллиона моноцитов в ~20 μL и измеряйте в течение примерно 10 минут. Выберите и пометьте поток кислорода и сигнал TMRM как «Ячейка».
  3. Пермеабилизируйте клетки путем введения 2 мкл 1 мг/мл дигитонина (конечная концентрация: 4 мкг/мл). Ждем 20 минут. Выберите и пометьте поток кислорода и сигнал TMRM как «Dig».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагается оптимизировать концентрацию дигитонина в отдельных экспериментах.
  4. Добавьте 2,5 мкл 1 М сукцината (конечная концентрация: 5 мМ). Выберите и обозначьте поток кислорода и сигнал TMRM как «SUCC».
  5. Когда поток кислорода стабилизируется, добавьте 5 мкл 100 мМ малата (конечная концентрация: 1,0 мМ), 5 мкл 1 М глутамата (конечная концентрация: 10 мМ) и 5 мкл 500 мМ пирувата (конечная концентрация: 5 мМ). Выберите и обозначьте поток кислорода и сигнал TMRM как «MPG».
  6. Как только поток кислорода стабилизируется, титруйте АДФ. Выберите скорости для каждого титрования и обозначьте их буквой «D» последовательно от 1 до 10, в зависимости от количества титрований. Используйте схему титрования, приведенную в таблице 2.
  7. После того как поток кислорода стабилизируется, проведите серию титрований по 1 мкл 0,25 мМ карбонильцианида p-(трифлурометокси) фенил-гидразона (FCCP) до тех пор, пока флуоресцентный сигнал не достигнет максимума. Выберите и обозначьте поток кислорода и сигнал TMRM, представляющий минимальный мембранный потенциал, и обозначьте его как «FCCP».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация FCCP 0,5-1,0 мкМ обычно требуется для истощения потенциала митохондриальной мембраны.
    ВНИМАНИЕ: FCCP токсичен. Обратитесь к паспорту безопасности (SDS) для правильного обращения.
  8. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Как только поток кислорода стабилизируется, введите 1 мкл 0,25 мМ ротенона для ингибирования комплекса I и определения дыхательной способности с помощью комплекса II.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения потенциала мембраны больше не актуальны после титрования с развязкой.
    ВНИМАНИЕ: Ротенон токсичен. Обратитесь к паспорту безопасности для правильного обращения.
  9. Как только поток кислорода стабилизируется, введите 1 мкл 1,25 мМ (конечная концентрация: 2,5 мкМ) антимицина А, чтобы подавить митохондриальное дыхание.
    ВНИМАНИЕ: Антимицин А токсичен. Обратитесь к паспорту безопасности для правильного обращения.

5. Расчет потенциала митохондриальной мембраны и анализ

  1. Используя эксперименты с холостыми дисками, запишите откалиброванные значения TMRM (микромолярные TMRM) перед введением холостого образца («предварительного образца») и для каждой из инъекций. Смотрите Рисунок 2.
  2. Для каждого эксперимента с заготовкой рассчитайте фоновое отношение, установив концентрацию TMRM для предварительной выборки равной 1,0. Рассчитайте последующее пропорциональное уменьшение TMRM. Рассчитайте среднее соотношение фона по всем пустым экспериментам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество экспериментов с холостыми дисками может зависеть от точности прибора. В таблице 3 приведен пример расчета из пяти различных экспериментов с бланками, в которых стандартное отклонение среднего фонового коэффициента колебалось от 0 до 0,016 для каждого титрования.
  3. Расчет фона: Рассчитайте фон для каждого эксперимента с образцом, умножив TMRM образца на средний коэффициент фона для каждой инъекции. Пример расчета приведен в таблице 3.
  4. Коррекция фона: вычтите фон эксперимента из измеренных значений TMRM образца. Пример расчета приведен в таблице 4.
  5. Коррекция FCCP: вычитание мМП с коррекцией фона FCCP из каждой инъекции. Пример расчета приведен в таблице 4.
  6. Кривая чувствительности ADP: Нормализуйте снижение mMP, вызванное ADP, установив максимальный и самый низкий потенциал мембраны на 100% и 0% соответственно, используя значения mMP, собранные во время титрования ADP. Подгонка данных в модель регрессии нелинейной аппроксимации с использованием предпочитаемого статистического программного обеспечения для расчета полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) АДФ на мМП.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кривая соответствует [Ингибитор] и нормализованной реакции - Переменный наклон в призме.

figure-protocol-13647
Рисунок 2: Расчет потенциала митохондриальной мембраны (мМП) и чувствительности АДФ по флуоресценции TMRM. Этапы расчета потенциала митохондриальной мембраны (мМП) и чувствительности АДФ по результатам измерений флуоресценции TMRM методом флуоресценции высокого разрешения одного образца Т-клеток (n = 1). Шаг 1: Флуоресценция TMRM измеряется в чистых образцах так же, как и в биологическом образце. Шаг 2: Определите соотношение в сигнале TMRM при каждом титровании относительно сигнала перед выборкой для каждого эксперимента с холостым патроном. Рассчитайте среднее значение для каждого титрования всех пустых экспериментов. Шаг 3: Рассчитайте фон для каждого эксперимента с образцом, умножив флуоресценцию «предварительного образца» на среднее отношение фона для каждого титрования. Шаг 4: Рассчитайте разницу между фоновой и образцом флуоресценции TMRM для каждого титрования, чтобы выразить данные в виде мМП или митохондриального поглощения TMRM. Шаг 5: Скорректируйте mMP так, чтобы полное разъединение с FCCP отражало ноль mMP. Шаг 6: Выполните нелинейную регрессию для построения графика изменений в мМС с увеличением концентрации АДФ. Измерения проводились в камерах объемом 0,5 мл, одна из которых содержала 5 миллионов Т-клеток здорового добровольца. Усредненные данные выражаются как среднее значение ± SEM. Отдельные точки данных одной реплики выражаются без полос погрешностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Результаты

Чтобы проиллюстрировать различия в оптимальной концентрации клеток для анализа, 5 миллионов Т-клеток были загружены в одну камеру объемом 0,5 мл (10 миллионов клеток/мл), а 1,25 миллиона клеток были загружены в другую камеру (2,5 миллиона клеток/мл), содержащую 1 μМ TMRM (рис. 3A-G). Также были включены три пустых эксперимента для расчета фона TMRM. Мы обнаружили, что более высокая концентрация Т-клеток приводит к более заметному изменению флуоресценции TMRM относительно фона (рис. 3B, D). Кроме того, более высокая концентрация клеток позволила нам обнаружить ожидаемое увеличение потребления кислорода и одновременное истощение mMP в ответ на добавление FCCP (рис. 3E, F). Использование низкой концентрации клеток дало слабое изменение флуоресценции, которое шло параллельно фону. Поскольку при расчете мМП из сигнала вычитается фон, низкая концентрация клеток не позволяет определить изменения мМП в ответ на подложки и размыкатели. В дополнение к использованию более высоких концентраций клеток в этом анализе, мы рекомендуем поддерживать постоянную концентрацию клеток для каждого типа клеток между экспериментами.

Чтобы проверить влияние АТФ-синтазы на диссипацию mMP при титровании АДФ, мы провели параллельные эксперименты на PBMC и Т-клетках, в которых одна камера получала олигомицин перед титрованием ADP (рис. 4). Мы не обнаружили диссипации mMP в ответ на АДФ в клетках, обработанных олигомицином, что позволяет предположить, что постепенное снижение mMP при АДФ является результатом потока протонов через АТФ-синтазу (рис. 4A-F). Мы также сравнили чувствительность АДФ между Т-клетками и PBMC одного и того же участника и обнаружили, что чувствительность АДФ ниже (выше EC50) во фракции Т-клеток (рис. 4G, H).

Мы провели серию холостых экспериментов для определения влияния времени или протокола SUIT на флуоресценцию TMRM. Мы обнаружили, что сигнал TMRM в экспериментах с холостыми патронами в основном зависит от титрования SUIT (рис. 5A), а не от времени титрования (рис. 5B).

Мы сравнили вызванные АДФ изменения скорости потребления кислорода (OCR) и мМП в Т-клетках и моноцитах у 11 здоровых добровольцев, проживающих в общественных местах (рис. 6A-H). Подобно ранее опубликованным экспериментам с использованием внеклеточного потока и ферментативных анализов, моноциты продемонстрировали большую митохондриальную дыхательную способность, чем лимфоциты 26,27 (рис. 6A,H). Тем не менее, мы не обнаружили типичного увеличения зависимости «доза-реакция» при ОКР при АДФ ни в одном из типов клеток (Рисунок 6C, D), в отличие от того, что показывает этот метод при использовании высокометаболических тканей, таких как печень мыши (Рисунок 7A-H). С другой стороны, использование TMRM позволило нам обнаружить постепенное снижение mMP при АДФ в иммунных клетках человека (рисунок 6E-G) и в Т-клетках селезенки мышей (рисунок 7E-H). Несмотря на то, что мы не сравнивали Т-клетки человека и мыши напрямую с использованием одного и того же протокола титрования, мы обнаружили, что IC50 Т-клеток мыши был ниже в 10 раз по сравнению с циркулирующими Т-клетками человека.

figure-results-4019
Рисунок 3: Эксперименты с флуореспирометрией высокого разрешения. (A-D) Следы экспериментов с флуореспирометрией высокого разрешения с использованием концентраций Т-клеток 10 миллионов клеток/мл и 2,5 миллионов клеток/мл в камерах 0,5 мл. (А) 10 миллионов клеток/мл в камерах объемом 0,5 мл. (C) 2,5 миллиона клеток/мл в камерах объемом 0,5 мл. Поток кислорода (пмоль/с/мл) отображается на верхней панели (красный цвет), а откалиброванный сигнал TMRM — на нижней панели (черный). Изменения TMRM на протяжении всего SUIT для образца и его расчетный фон были построены для камер, содержащих (B) 10 млн клеток/мл и (D) 2,5 млн клеток/мл. (E) Для каждой концентрации клеток рассчитывали поток кислорода (пмоль/с/миллион клеток) и (F) потенциал митохондриальной мембраны. (G) Кривая чувствительности ADP была построена и подогнана к модели нелинейной регрессии (сплошные линии). Сокращения: mMP — потенциал митохондриальной мембраны; TMRM, метиловый эфир тетраметилродамина; SUIT, титрование субстрата-разъединителя-ингибитора; АДФ, аденозиндифосфат; Дигтонин, дигитонин; Mal, малат; пир, пируват; Глют, глутамат; D1-11, 11 последовательных титрований ADP; U, развязывающее FCCP 0,5 и 1,0 мкМ; АМА, антимицин А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5774
Рисунок 4: АТФ-синтаза приводит к вызванному АДФ снижению мембранного потенциала в Т-клетках и PBMC. (A-H) Описанный здесь протокол был протестирован на PBMC и Т-клетках. В две камеры O2K были введены PBMC, а в две камеры еще одного O2K были введены Т-клетки от того же участника. После введения субстратов малата, пирувата и глутамата во все камеры в одну камеру PBMCs и Т-клеток получался олигомицин. Олигомицин предотвращал любое вызванное АДФ повышение дыхания в (A) PBMC и (D) T-клетках или снижение потенциала митохондриальных мембран в PBMC (B,C) и (E,F) Т-клетках. (Г,Н) Чувствительность к АДФ была выше в PBMC по сравнению с Т-клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6982
Рисунок 5: Эксперименты с бланками показывают изменение флуоресценции TMRM в ответ на время и титрование субстратов, развязчиков и ингибиторов (SUIT). (A) Изменение флуоресценции TMRM в ответ на титрование. (B) Изменение флуоресценции TMRM в зависимости от времени. Эксперименты проводились в камерах объемом 0,5 мл, заполненных препаратом Мир05, содержащим 1 мкМ TMRM. В одной камере не проводилось никаких титрований SUIT (инъекций); две камеры в двух разных инструментах получили стандартный протокол костюма (стандартный впрыск); одна камера получала те же титрования SUIT, но с задержкой между каждым впрыском (отложенный впрыск). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8027
Рисунок 6: Различия в чувствительности АДФ между Т-клетками и моноцитами с использованием OCR и mMP. (A) След эксперимента с флуореспирометрией высокого разрешения из образца моноцитов и Т-клеток субъекта. (В) Потребление кислорода в моноцитах (n=11) и Т-клетках (n=13) из крови здоровых добровольцев. (К,Г) Нелинейная регрессионная аппроксимация построенного на графике повышения дыхания с титрованием ADP для расчета EC50. (E) Одновременное измерение потенциала митохондриальной мембраны. (Ф,Г) Нелинейная регрессионная аппроксимация графика снижения потенциала митохондриальной мембраны с титрованием АДФ для расчета IC50. (H) Параметры дыхательной способности моноцитов и Т-клеток. Данные выражаются как среднее значение ± SEM для линейных графиков и среднее значение ± SD для столбчатых диаграмм. Статистически значимые различия после t-критерия выражаются в виде *p < 0,05. **p < 0,01, а ****p < за 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9473
Рисунок 7: Сравнение ответа АДФ на дыхание и потенциал митохондриальной мембраны (мМП) в пермеабилизированных Т-клетках селезенки и печени мышей. (A-D) Ответ на дыхание в пермеабилизированных Т-клетках селезенки мыши и печени. (Э-Х) Реакция в мМП в пермеабилизированных Т-клетках селезенки мыши и печени. Свежая печень и селезенка были препарированы у трех мышей после вывиха шейки матки. Т-клетки селезенки Pan выделяли с помощью разделения магнитных шариков, конъюгированного антителами. Оба образца подвергались одинаковому протоколу SUIT в присутствии 1 мкМ TMRM. (И,Дж) Сравнение EC50, рассчитанного по увеличению потребления кислорода (OCR), и IC50 по уменьшению mMP в ответ на АДФ. N = 3 на группу. Данные выражены как среднее значение ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Пример протокола SUIT для оценки потенциала митохондриальной мембраны в свежевыделенных Т-клетках и моноцитах с использованием камер объемом 0,5 мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Рекомендуемое титрование АДФ для камеры объемом 0,5 мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Расчет среднего коэффициента фона с использованием пяти независимых тестовых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: Расчет потенциала митохондриальной мембраны (мМП) по результатам эксперимента с образцом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Влияние Mir05 и ДМСО на митохондриальное дыхание и мембранный потенциал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Приготовление реагента и протокол выделения Т-клеток из селезенки мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В этом протоколе используется флуореспирометрия высокого разрешения для измерения чувствительности митохондриального ответа на потребность в энергии путем измерения диссипации mMP в ответ на повышение уровня АДФ в PBMC, моноцитах и Т-клетках. Это делается путем добавления сложных субстратов I и II для максимизации потенциала митохондриальной мембраны и титрования АДФ для постепенной стимуляции АТФ-синтазы для использования протонного градиента для генерации АТФ.

Важнейшие шаги в протоколе включают установку коэффициента усиления и интенсивности флуорофора на 1000 и обеспечение получения флуоресцентного сигнала TMRM во время титрования TMRM. Поскольку флуоресценция TMRM снижается после каждого титрования (ограничение этого метода), крайне важно проводить фоновые эксперименты с использованием пустых образцов. Мы также обнаружили, что ДМСО оказывает ингибиторное действие на митохондриальное дыхание и мембранный потенциал, поэтому рекомендуем разбавлять рабочий раствор TMRM в Mir05 (дополнительный рисунок 1).

Некоторые модификации, которые могут быть использованы при использовании этого протокола, включают регулировку концентрации клеток и использование стандартной камеры объемом 2 мл. Тем не менее, камера объемом 0,5 мл предпочтительна для Т-клеток и моноцитов из-за высокой концентрации клеток, необходимой для оптимального ответа на мембранный потенциал и поток кислорода. Более низкая концентрация клеток может быть оптимальной при тестировании клеток с большей дыхательной способностью, таких как макрофаги.

Дополнительные ограничения представленного здесь метода включают потребность не менее чем в 5 миллионах Т-клеток и 2,5 миллионах моноцитов. Мы часто можем получить достаточное количество клеток из ~20 мл крови здоровых участников, но эти цифры могут варьироваться в зависимости от состояния здоровья, возрастаи пола. Кроме того, как и в большинстве методов оценки митохондриальной емкости, клетки должны быть только что изолированы. Тем не менее, этот метод может быть опробован в криоконсервированных клетках в будущем. По сравнению с выходом из крови человека, выход Т-клеток из селезенки здоровых мышей достаточно высок для проведения данного анализа.

Циркулирующие Т-клетки, особенно долгоживущие клетки памяти (TM) и регуляторные (Treg), полагаются на окислительное фосфорилирование для получения энергии. В то время как их потребность в энергии и потребление кислорода низки (например, по сравнению с мышцами в состоянии покоя), их выживание имеет важное значение для эффективного иммунного ответа на повторное заражение и рак 38,39,40. Снижение окислительного фосфорилирования Т-клеток приводит к нарушению пролиферативной способности и способствует истощению и старению Т-клеток 5,41. Кроме того, митохондриальная гиперполяризация способствует устойчивой продукции цитокинов (IL-4 и IL-21) эффекторными CD4 Т-клетками во время активации42. После инфицирования потребность в энергии для активации и пролиферации иммунных клеток может достигать 25-30%от основного метаболизма. Таким образом, иммунные клетки функционируют в широком и экстремальном диапазоне энергетических потребностей, и этот протокол может проверить митохондриальные реакции в этом диапазоне.

Хроническое воспаление является общим признаком ожирения, диабета и старения. Нерегулируемые уровни циркулирующих гормонов, липидов и глюкозы оказывают системное воздействие и, таким образом, могут влиять на то, как митохондрии реагируют на энергетическую задачу. Здесь мы представили метод оценки чувствительности митохондриального АДФ в циркулирующих PBMC. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, как чувствительность к АДФ может модулироваться при метаболических заболеваниях и как это влияет на состояние здоровья.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить добрых волонтеров, которые сдали кровь для этого проекта. Мы также выражаем нашу искреннюю признательность доктору Эллен Шур и ее команде за предоставление нам дополнительных образцов из их исследования. Мы также хотели бы поблагодарить Эндрю Кирша за рецензирование рукописи и редактирование ее для удобочитаемости. Эта работа была поддержана следующими источниками финансирования: P01AG001751, R01AG078279, P30AR074990, P30DK035816, P30DK017047, R01DK089036, K01HL154761, T32AG066574.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine DiphosphateSigma-AldrichA5285Fluorespirometry
Antimycin ASigma-AldrichA8674Fluorespirometry
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA6003Mir05 buffer
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA6003Cell isolation
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazoneSigma-AldrichC2920Fluorespirometry
Cell strainersFisher Scientific22-363-548Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
CD14 Microbeads, humanMiltenyi Biotec130-050-201Cell isolation
CD3 Microbeads, humanMiltenyi Biotec130-050-101Cell isolation
DatLabOroborosVersion 8
DigitoninSigma-AldrichD141Fluorespirometry
D-SucroseSigma-Aldrich84097Mir05 buffer
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)Sigma-AldrichE4378Mir05 buffer
Filter Set AmROroboros44321-01
HBSS (10x)Gibco12060-040
HEPES sodium saltSigma-AldrichH7523Mir05 buffer
Histopaque 1077Sigma-Aldrich10771Cell isolation
K2EDTA blood collection tubesBD Vacutainer366643Cell isolation
Lactobionic acidSigma-Aldrich153516Mir05 buffer
L-Glutamic acidSigma-AldrichG1626Fluorespirometry
L-Malic AcidSigma-AldrichM1000Fluorespirometry
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401Cell isolation
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM9272Mir05 buffer
Multi-MACS stand and MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-301Cell isolation
O2k-Fluo Smart-ModuleOroboros12100-03
O2k-FluoRespirometer series JOroboros10201-03
O2k-sV-Module (0.5 chamber)Oroboros11200-01
OligomycinSigma-Aldrich04876Fluorespirometry
Pan T Cell Isolation Kit II, mouseMiltenyi130095130Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662Mir05 buffer
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich221473Mir05 buffer
PrismGraphPadVersion 10
RotenoneSigma-AldrichR8875Fluorespirometry
RPMI BufferCorning17-105-CVCell isolation
Sodium PyruvateSigma-AldrichP2256Fluorespirometry
Succinate disodium saltSigma-AldrichS2378Fluorespirometry
TaurineSigma-AldrichT0625Mir05 buffer
Tetramethyrhodamine methyl ester perchloriteSigma-AldrichT5428Fluorespirometry

Ссылки

  1. Eisner, V., Picard, M., Hajnóczky, G. Mitochondrial dynamics in adaptive and maladaptive cellular stress responses. Nat Cell Biol. 20 (7), 755-765 (2018).
  2. Sokolova, I. Bioenergetics in environmental adaptation and stress tolerance of aquatic ectotherms: linking physiology and ecology in a multi-stressor landscape. J Exp Biol. 224, 236802 (2021).
  3. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells). Biochem J. 312, 163-167 (1995).
  4. Schmid, D., Burmester, G. R., Tripmacher, R., Kuhnke, A., Buttgereit, F. Bioenergetics of human peripheral blood mononuclear cell metabolism in quiescent, activated, and glucocorticoid-treated states. Biosci Rep. 20 (4), 289-302 (2000).
  5. Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21 (9), 1022-1033 (2020).
  6. Nelson, S. R., Li, A., Beck-Previs, S., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M. Imaging ATP consumption in resting skeletal muscle: One molecule at a time. Biophys J. 119 (6), 1050-1055 (2020).
  7. Meyrat, A., von Ballmoos, C. ATP synthesis at physiological nucleotide concentrations. Sci Rep. 9 (1), 3070 (2019).
  8. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709 (2011).
  9. Holloway, G. P., et al. Age-associated impairments in mitochondrial ADP sensitivity contribute to redox stress in senescent human skeletal muscle. Cell Rep. 22 (11), 2837-2848 (2018).
  10. Pharaoh, G., Brown, J., Ranjit, R., Ungvari, Z., Van Remmen, H. Reduced adenosine diphosphate sensitivity in skeletal muscle mitochondria increases reactive oxygen species production in mouse models of aging and oxidative stress but not denervation. JCSM Rapid Commun. 4 (1), 75-89 (2021).
  11. Pharaoh, G., et al. The mitochondrially targeted peptide elamipretide (SS-31) improves ADP sensitivity in aged mitochondria by increasing uptake through the adenine nucleotide translocator (ANT). Geroscience. 45 (6), 3529-3548 (2023).
  12. Brunetta, H. S., Petrick, H. L., Vachon, B., Nunes, E. A., Holloway, G. P. Insulin rapidly increases skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity in the absence of a high lipid environment. Biochem J. 478 (13), 2539-2553 (2021).
  13. Brunetta, H. S., et al. Nitrate consumption preserves HFD-induced skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity and lysine acetylation: A potential role for SIRT1. Redox Biol. 52, 102307 (2022).
  14. Tyrrell, D. J., et al. Blood-cell bioenergetics are associated with physical function and inflammation in overweight/obese older adults. Exp Gerontol. 70, 84-91 (2015).
  15. Liepinsh, E., et al. Low-intensity exercise stimulates bioenergetics and increases fat oxidation in mitochondria of blood mononuclear cells from sedentary adults. Physiol Rep. 8 (12), e14489 (2020).
  16. Hedges, C. P., et al. Peripheral blood mononuclear cells do not reflect skeletal muscle mitochondrial function or adaptation to high-intensity interval training in healthy young men. J Appl Physiol. 126 (2), 454-461 (2019).
  17. DeConne, T. M., Muñoz, E. R., Sanjana, F., Hobson, J. C., Martens, C. R. Cardiometabolic risk factors are associated with immune cell mitochondrial respiration in humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 319 (2), H481-H487 (2020).
  18. Zhou, B., et al. Boosting NAD level suppresses inflammatory activation of PBMCs in heart failure. J Clin Invest. 130 (11), 6054-6063 (2020).
  19. Altintas, M. M., DiBartolo, S., Tadros, L., Samelko, B., Wasse, H. Metabolic changes in peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with end stage renal disease. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 629239 (2021).
  20. Pence, B. D., Yarbro, J. R. Aging impairs mitochondrial respiratory capacity in classical monocytes). Exp Gerontol. 108, 112-117 (2018).
  21. vander Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T Cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113, 11-14 (2016).
  22. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
  23. Buck, M. D., et al. Mitochondrial dynamics controls T Cell fate through metabolic programming. Cell. 166 (1), 63-76 (2016).
  24. Quinn, K. M., et al. Metabolic characteristics of CD8. Nat Commun. 11 (1), 2857 (2020).
  25. Scandalis, L., et al. Skeletal muscle mitochondrial respiration and exercise intolerance in patients with heart failure with preserved ejection fraction. JAMA Cardiol. 8 (6), 575-584 (2023).
  26. Rausser, S., et al. Mitochondrial phenotypes in purified human immune cell subtypes and cell mixtures. Elife. 10, e70899 (2021).
  27. Kramer, P. A., et al. Bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets. J Vis Exp. (85), e51301 (2014).
  28. Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biol. 2, 206-210 (2014).
  29. Teodoro, J. S., Machado, I. F., Castela, A. C., Rolo, A. P., Palmeira, C. M. The evaluation of mitochondrial membrane potential using fluorescent dyes or a membrane-permeable cation (TPP+) electrode in isolated mitochondria and intact cells. Methods Mol Biol. 2184, 197-213 (2020).
  30. Hassan, H., Zakaria, F., Makpol, S., Karim, N. A. A link between mitochondrial dysregulation and idiopathic autism spectrum disorder (ASD): Alterations in mitochondrial respiratory capacity and membrane potential. Curr Issues Mol Biol. 43 (3), 2238-2252 (2021).
  31. Williams, A. S., et al. Disruption of Acetyl-Lysine turnover in muscle mitochondria promotes insulin resistance and redox stress without overt respiratory dysfunction. Cell Metab. 31 (1), 131-147 (2020).
  32. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  33. Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Biosci Rep. 36 (1), 00286 (2015).
  34. Vianello, C., et al. High-throughput microscopy analysis of mitochondrial membrane potential in 2D and 3D models. Cells. 12 (7), (2023).
  35. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  36. JoVE, Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , (2023).
  37. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  38. Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. J Clin Invest. 123 (10), 4479-4488 (2013).
  39. Gerriets, V. A., et al. Foxp3 and Toll-like receptor signaling balance T. Nat Immunol. 17 (12), 1459-1466 (2016).
  40. MacIver, N. J., Michalek, R. D., Rathmell, J. C. Metabolic regulation of T lymphocytes. Annu Rev Immunol. 31, 259-283 (2013).
  41. Desdín-Micó, G., et al. T cells with dysfunctional mitochondria induce multimorbidity and premature senescence. Science. 368 (6497), 1371-1376 (2020).
  42. Yang, R., et al. Mitochondrial Ca2+ and membrane potential, an alternative pathway for Interleukin 6 to regulate CD4 cell effector function. Elife. 4, 06376 (2015).
  43. Straub, R. H., Cutolo, M., Buttgereit, F., Pongratz, G. Energy regulation and neuroendocrine-immune control in chronic inflammatory diseases. J Intern Med. 267 (6), 543-560 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены