Анализ термостойкости с использованием системы мониторинга активности дрозофилы : руководство по исполняемому приложению для анализа данных

Резюме

В этом отчете описывается метод измерения времени до нокдауна взрослой особи Drosophila melanogaster с помощью монитора активности дрозофилы (DAM2) в ответ на тепловой стрессор воздушной проводимости в камере инкубатора. DAM2 измеряет активность, записывая движения отдельных мух, когда они пересекают инфракрасный луч. Анализ данных облегчается новым исполняемым файлом, созданным авторами.

Аннотация

Изучение устойчивости к жаре у Drosophila melanogaster представляет особый интерес для исследователей на протяжении десятилетий, при этом общий подход к оценке устойчивости к жаре заключается в мониторинге времени до нокдауна (TKD) после воздействия повышенной температуры. Классически мух помещают в отдельные флаконы и помещают внутрь водяной бани с подогревом. Затем ТКД контролируется исследователями вручную. Несмотря на то, что эти исследования хорошо известны, остаются проблемы субъективности и последовательного применения осязаемого определения прекращения всех движений, включая мышечные спазмы, при проведении этих ручных анализов. Мы разработали высокопроизводительный метод автоматизации анализов термостойкости с использованием мониторов активности дрозофилы TriKinetics (DAM2). Для сопровождения системы DAM2 мы написали программу и создали простой в использовании исполняемый файл для автоматического считывания последнего времени движения по сгенерированным данным об активности. Затем этот скрипт записывает в файл .csv время до теплового паралича (TKD) для каждой мухи. Наши данные показывают, что этот автоматизированный метод DAM2 является последовательным и надежным. Между тем, профили активности, созданные на основе данных о количестве активности, представляют интерес. Эти профили активности могут быть составлены и имеют потенциал для расширения анализов термотолерантности, чтобы включить в них относительно неизученные поведенческие компоненты термотолерантности. В этом протоколе будет подробно описано, как пользоваться системой DAM2 и HoTDAM! программное обеспечение для оценки теплостойкости у D. melanogaster.

Введение

Эктотермы обычно реагируют на тепловой стресс повышенной локомоторной активностью. Этот феномен был очевиден исследователям на протяжении десятилетий, а характерная поведенческая реакция была описана Коулзом и Богертом в 1944^году. Они описали, как организм при тепловом стрессе сначала проявляет повышенную двигательную двигатель. По мере нарастания теплового стресса короткие всплески активности перемежаются периодами бездействия. Температура, при которой организм больше не может демонстрировать скоординированное движение, является критическим тепловым максимумом (CTmax). Далее следует мышечный спам, и в конечном....

протокол

1. Разведение мух

1. Выберите подходящий материал/линию для исследования.
   Примечание: Чтобы проиллюстрировать анализ, мы использовали нокаутный запас транзиентного рецептора TRPA1 и его генетический контроль, запас w¹¹¹⁸ .
2. При необходимости поддерживайте поголовье мух в постоянных условиях. Чтобы следовать этому протоколу, храните запасы при температуре 25 °C в суточном цикле 12:12 на стандартных продуктах питания (кукурузная мука, патока и дрожжи торула).
3. Разделите самцов и самок с помощью легкой анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от эксперимента, могу....

Результаты

Анализ акций TRPA1 и w¹¹¹⁸ проводился отдельно. Процентиль умножения TKD и другие описательные данные можно найти в таблице 1.

			Процентилиa

Обсуждение

Метод определения термостойкости, который мы описываем здесь, является универсальным и масштабируемым. Ранее мы опубликовали валидационное исследование, в котором сравнили тест HoTDAM! к классическому, основанному на наблюдении анализу TKD и обнаружил, что автоматическ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL polystyrene test tubes	Falcon	352057
30 gallon fish tank	Wal-mart
8 oz bottles	Genesee	32-129F
Constant Climate Chamber	Memmert	HPP750eco
cornmeal	Lab Scientific	FLY801010
DAM2  Drosophila Activity Monitor	TriKinetics	DAM2	(DAMSystem3 Data Sheet) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf
DAMSystem data acquisition software	TriKinetics		free download
Drosophila agar	Lab Scientific	FLY80201
ethanol	Fisher Scientific	BP82011
Ether	Fisher Scientific	E134-4
FileScan software	TriKinetics		for scanning for text errors, binning data, and output
FlyStuff Flugs for bottles	Genesee	49-100
FlyStuff Flugs for vials	Genesee	49-102
FlyStuff vials	Genesee	32-113RL
HoTDAM software	Github or Trikinetics		https://github.com/MatthewR47/HoTDAM
Immersion circulating heater	PolyScience	MX-CA11B
molasses	Lab Scientific	FLY80084
propionic acid	Fisher Scientific	A258-500
Pyrex Glass tubes 5 x 65 mm for DAM2	TriKinetics	PGT 5x65	https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf
small paint brush	Wal-mart
SPSS Statistics	IBM
tegosept	Lab Scientific	FLY55015
torula yeast	MP Biomedicals	290308505
TRPA1 mutant stock	Bloomington Stock center	26504	w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1]
w1118 stock	Bloomington Stock center	3605