Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области легких иммунитета о том, как оценить экспрессию микроРНК, которые, по прогнозам, регулируют воспалительные гены в легких. Этот метод предлагает простой способ определения вклада циркулирующих гормонов в экспрессию микроРНК легких. Чтобы оценить этап цикла эструса, вручную сдерживайте восьми-девятинедельную самку мыши и ввемите кончик пластиковой 10-микролитровой пипетки, наполненной ультра-чистой водой, во влагалище.
Аккуратно смойте четыре-пять раз, чтобы собрать образец, и депонировать окончательный флеш вагинальной жидкости на стеклянную горку. Затем наблюдайте неоближенный вагинальный флеш под световым микроскопом при увеличении 20X. Для воздействия озона и фильтрованного воздуха поместите максимум четырех мышей в один из двух отдельных 1,2-литровых стеклянных контейнеров с проволочными крышками сетки.
Поместите один стеклянный контейнер в озоновую камеру и один в фильтрованную камеру воздействия воздуха. Затем отрегулируйте концентрацию озона до двух частей на миллион, удалив контейнер через три часа. Через четыре часа после воздействия, дезинфицировать открытые поверхности кожи первой экспериментальной мыши с 70% этанола и отрезать грудную клетку подвергать сердце и легкие.
Используйте типсы, чтобы погрузить 1,5 миллилитр RNase свободной микро центрифуги трубки в жидком азоте, и оснастки заморозить собранных легких в жидком азоте. Затем используйте пульверизатор ткани из нержавеющей стали, чтобы масцератировать все легкое, и разделить распыленной ткани между двумя 1,5 миллилитров микроцентрифуг труб. После сбора урожая и распыления легких от всех животных таким же образом, добавить 500 микролитров гуанидиниума тиоцианата в каждый образец и последовательно гомогенизировать каждую ткань с 18, 21 и 23 иглы датчика.
После последней гомогенизации добавьте 500 микролитров этанола в каждый образец перед вихрем в течение 15 секунд. Загрузите смеси в отдельные колонки спина в отдельных трубках сбора для центрифугации и отбросить потоковые ветви. Для лечения DNase 1 добавьте 400 микролитров буфера промывки РНК к каждому столбецу для другой центрифугации и смешайте пять микролитров DNase 1 и 75 микролитров буфера пищеварения ДНК на образец в трубках, свободных от RNase.
Добавить смесь непосредственно в колонке матрицы для 15-минутной инкубации при комнатной температуре, а затем два 400 микролитер РНК предварительно промыть раствор моет центрифугации. Чтобы утоить РНК, добавьте 35 микролитров воды без DNase RNase непосредственно к каждой матрице столбца для окончательной центрифугации и измерьте общую концентрацию РНК и чистоту каждого образца на спектрофотометре. Затем храните РНК при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Для ретротранскриптирования малых RNase, добавить 200 нанограммов общей РНК в 10 микролитров предполетного раствора в одну трубку обратной транскрипции реакции смеси на образец. После смешивания, кратко центрифуга образцов и поместить их на лед до их инкубации. Затем инкубировать трубки в течение 60 минут при 37 градусах по Цельсию, а затем пятиминутную инкубацию при 95 градусах по Цельсию.
В конце второй инкубации разбавляйте CDNA 200 микролитров воды без RNase на 20 микролитровую реакцию обратной транскрипции и добавляйте 10 микролитров каждого образца смеси реакции к каждому колодец предустановленной воспалительной реакции мыши и массива микроРНК autoimmunity. Стадию проэструса можно определить по наличию круглых и хорошо сформировавшейся нуклеиновых эпителиальных клеток. Когда мышь находится в стадии эструса, в мазке наблюдаются плотно упакованные скопления ануклеированных, оцинковых и плоскоклеточных эпителиальных клеток.
Во время метеструса видны окаменелые эпителиальные клетки и полиморфонуклеарные лейкоциты. В diestrus, лейкоциты, как правило, более распространены. РНК, извлеченная из четырех легких мыши, как было продемонстрировано, показывает концентрации нуклеиновой кислоты в диапазоне от 1198 до 2178 нанограмм на микролитер и среднее соотношение A260 к A280 между 2,01 и 2,02, и среднее соотношение A260 к A230 между 2.139 и 2.223.
В этой таблице показаны двукратные изменения в экспрессии микроРНК между озоном и фильтрованными воздушными мышами. После целевого фильтра микроРНК и анализа ядра для 14 микроРНК, чтобы получить значительное соотношение журналов экспрессий и значений P, эти данные могут быть отображены целевым фильтром микроРНК. Основной анализ также содержит информацию о канонических путях, болезнях и функциях, регуляторных службах и сетях.
Кроме того, программное обеспечение для функционального анализа может быть использовано для получения сетевого анализа, который показывает связь между микроРНК, представляющими интерес, и другими молекулами. При попытке этой процедуры, важно, чтобы проверить цикл estrus ежедневно, по крайней мере три последовательных циклов до проведения эксперимента. После этой процедуры, другие методы могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о экспрессии генов легких воспалительных через цикл эструса.
После его развития, этот метод проложил путь для других исследователей в области иммунитета легких, чтобы исследовать механизмы регулирования половых гормонов с использованием других моделей.
