Этот метод позволяет быстро in vivo скрининга у мышей, эффект трансгена, и специально адаптированы для выполнения усиления или потери функции исследований, а также ответ и ДНК мотив картирования. Основным преимуществом этой техники является то, что прогноз использования трансгенных животных выше 70% новорожденных и может быть применен к любым штаммам мыши, включая трансгенных животных. После усыпания мышей, собирать яйцеклетки.
Чтобы начать операцию, используйте ножницы, чтобы сделать большой горизонтальный разрез в брюшную полость. Затем найдите яйцеклетку между маткой и яичником. Далее используйте изогнутые типсы для удаления мезометриума и мембраны с выдающимися кровеносными сосудами.
Затем отделить яйцеклетку от яичника и вскрыть яйцеклетку из яичника. Затем буксир на яйцеклетку и отрезать от матки. Перенесите все собранные яйцеклетки на М2 при комнатной температуре.
При обработке овидуков, будьте осторожны, чтобы избежать прикосновения опухшие ампулы загружены оплодотворенными яйцами. Затем добавьте 100 микролитровую каплю гиалуронидазы рабочего раствора в 10-сантиметровую тарелку. Затем перенесите в него два яйцеклетки, чтобы удалить кучевые клетки из яиц.
Под стереомикроскопом используйте пару инсулиновых шприцев для защиты яйцеклетки при разрыве ампулы и рассеивании оплодотворенных яйцеклеток. Затем используйте подготовленную стеклянную пипетку с трубкой и мундштук, чтобы аспирировать все яйца. Используя этот инструмент, перенесите их между шестью каплями среды M2, чтобы смыть окружающие клетки кумуля.
Затем перенесите вымытые яйца в 10-миллиметровый колодец, в четырех хорошо пластины, наполненные разогретыми с M16. Затем перенесите блюдо в увлажненные 37 градусов по Цельсию инкубатор. В процессе подготовки центрифуга подготовленной лентивирусной векторной суспензии на 160 г в течение двух минут, чтобы гранулировать мусор, часто присутствующий в лентивирусном запасе.
В шкафу безопасности второго класса перенесите супернатанты в новую 0,5 миллилитровую трубку. Затем загрузите один микролитер супернатанта в инъекционный пипетку. Затем прикрепите инъекцию пипетки к правой стороне микроманипулатера.
И прикрепите удерживаемую пипетку к левому боковой микроманипулятору. Теперь, обойтись без восьми микролитров M2 среды в центре депрессии слайда. И накрыть легким парафинового масла, чтобы избежать испарения.
Затем поместите 20 яиц в неглубоких местах в падении, не создавая пузырьков. Далее убедитесь, что кончик инъекционной пипетки открыт. Если нет, нажмите на инъекцию пипетки с удерживанием пипетки, чтобы открыть его.
Затем установите микроинъектор на 20 секунд инъекций. Теперь, используя удерживая пипетку и ручное давление аспирировать оплодотворенную яйцеклетку, которая содержит два pronuclei и два полярных тела. Затем, используя инъекцию пипетки ввести перивителлин пространство яйца.
Не прикасайтесь к плазменной мембране. Отрегулируйте давление так, чтобы перивильное пространство было заполнено раствором. Давление не должно превышать 600 гекто паскаля.
Сразу же после введения 20 яиц, передать партию в ванну разогретой M16 среды. И инкубировать их, по крайней мере 30 минут, прежде чем имплантировать их. Через 16 часов после спаривания нормальных самок с самцами с вазэктомиями, проверьте наличие разъемов для совокупления.
Используйте этих самок для имплантации. Далее сделайте имплантационые пипетки с внутренним диаметром около 150 микрон. И с пламенем полированной советы, которые около четырех до пяти миллиметров в длину.
Загрузите пипетки с эмбрионом испытания, свет парафина нефти чуть выше точки плеча. Затем, аспирировать небольшой пузырь воздуха и дальнейшей загрузки пипетки со средним M2. Далее, аспирировать второй пузырь воздуха.
Теперь нарисуйте эмбрионы в пипетки один за другим, минимизируя объем среды между эмбрионами. Закончите, аспирируя очень небольшую каплю парафинового масла, шириной всего один эмбрион. Подготовка реимплантации пипетки является ключевым и требует много практики.
Яйца в пипетки должны быть выровнены практически без среды между ними. Далее, после обезболивать мышь и подтверждая анестезию с помощью щепотки бритья с двух, двух сантиметровых полосок волос вдоль спинного мозга на уровне последнего ребра. Теперь поместите мышь на грелку на стерильное поле и драпировать ее, оставляя окно для открытой кожи.
Далее, дезинфицировать открытые кожи с чередующимися скрабы иодопродидона и 70 процентов этанола. Для имплантации сначала сделайте поперечный разрез на один сантиметр, а затем сдвиньте кожу с боковой стороны, пока яичник оранжевого цвета не будет виден через стенку тела. Затем сделайте пятимиллиметровый разрез с помощью тонких ножниц и возьмите жировую прокладку с атрауматическим бульдогом.
После того, как колодка схватилась, вытащите яичник, яйцеклетку и верхнюю часть матки. Затем найдите ампулу и сделайте гемизекцию ножницами vannas, на сегменте яйцеклетки, который связывает яичник с ампулой. Затем ввести перенесите пипетки эмбриона и выбросить яйца.
Остановка на первый пузырь воздуха после яйца были освобождены. Иметь необходимые материалы, подготовленные для повторения процедуры на втором яйцеклетке. И как только завершено, закрыть кожу с раны клипы.
Сразу же после закрытия кожи, внутриперитонея вводили обезболивающее и помещика поместить животное в камеру восстановления с 39 градусов по Цельсию нагревательный элемент. Монитор, пока он полностью не проснется. Трансгенные животные были созданы с помощью представленного метода.
Высокие лентивирусные векторы titer были произведены с использованием 2,3-килограммового базового усилителя для Neurogenin-3 для привода eGFP. Или в качестве контроля, фрагмент хромосомы шесть диск eGFP. Интеграция в эмбрионы была достаточно успешной.
Из эмбрионов, почки поджелудочной железы был секционирован и иммунотонных искать локализованное выражение eGFP. Более 90 процентов векторов, с усилителем Neurogenin-3, выразил eGFP в Neurog3 экспресс-клеток. Тем не менее, ни один из интегрированных векторов контроля выразил eGFP в зародыше поджелудочной железы.
Места интеграции Трансгена оценивались количественным ПЦР, используя ген CDX2 в качестве контроля. Среднее количество интеграционных объектов было около 20 с использованием конструкции Neurogenin-3, или 10 с использованием конструкции управления. Любопытно, что вирусный трансдукционный рейтер, используемый для конструкции Neurogenin-3, был примерно в два раза больше вектора контроля.
Предлагая связь между трансдукционной рейтер и число интеграций. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как генерировать большое количество основателей трансгенных эмбрионов с использованием перивителлин инъекции лентивирусных векторов с высокой эффективностью. После освоения, эта техника может производить до 50 животных-основателей в течение одного дня микроинъекции, если она выполнена должным образом.
После этой процедуры, другие методы, такие как titer pronuclear инъекции ДНК могут быть выполнены, для того, чтобы установить трансгенные линии мыши. Не забывайте, что работа с лентивирусными векторами подлежит разрешению местного комитета ГМО. Эти векторы могут быть чрезвычайно опасными и меры предосторожности всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
