هذه الطريقة تسمح بسرعة في فحص الجسم الحي في الفئران، من تأثير transgene، ويتم تكييفها خصيصا لأداء مكاسب أو فقدان الدراسات الدالة، فضلا عن إجابة ورسم خرائط دافع الحمض النووي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية، هي أن استخدام التنبؤ للحيوانات المعدلة وراثيا هي أكثر من 70٪ من حديثي الولادة ويمكن تطبيقها على أي سلالات الفئران بما في ذلك الحيوانات المعدلة وراثيا. بعد القتل الرحيم الفئران، وجمع oviducts.
لبدء الجراحة، استخدم المقص لإجراء شق أفقي كبير في تجويف البطن. ثم، حدد موقع oviduct بين الرحم والمبيض. بعد ذلك ، استخدم ملقطًا منحنية لإزالة mesometrium والغشاء مع الأوعية الدموية البارزة.
ثم، فصل oviduct من المبيض وتشريح أوفيدوكت من المبيض. ثم، سحب على oviduct وقطع بعيدا عن الرحم. نقل جميع oviducts التي تم جمعها إلى M2 المتوسطة في درجة حرارة الغرفة.
عند التعامل مع oviducts، يجب الحرص على تجنب لمس أمبولا منتفخة محملة بالبويضات المخصبة. المقبل، إضافة قطرة 100 ميكرولتر من حل عمل الهيالورونيداز إلى طبق 10 سم. ثم نقل اثنين من oviducts في ذلك، لإزالة خلايا الركام من البيض.
تحت مجسم مجسم، استخدم زوج من حقن الأنسولين لتأمين oviduct أثناء تمزيق الأمبولا وتشتيت البويضات المخصبة. ثم، استخدام ماصة الزجاج المعدة مع أنابيب وساعة لسان حال لpirate جميع البيض. باستخدام هذه الأداة، نقلها بين ست قطرات من M2 المتوسطة لغسل قبالة الخلايا الرمول المحيطة بها.
ثم، نقل البيض غسلها في بئر 10 ملليمتر، في لوحة أربعة بئر، مليئة بحماية M16. ثم، نقل الطبق إلى حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية. وفي إطار التحضير، تقوم أجهزة الطرد المركزي بتعليق ناقل العدس فيركال على 160 غراما لمدة دقيقتين، لتكوير الحطام الموجود في كثير من الأحيان في مخزون من فيروسات العدسي.
في الطبقة اثنين من مجلس الوزراء سلامة، نقل اغراء إلى أنبوب جديد 0.5 ملليلتر. المقبل، تحميل ميكرولتر واحد من سوبرنات، في ماصة حقن. ثم، إرفاق ماصة الحقن إلى الجانب الأيمن micromanipulater.
وإرفاق الماصة القابضة على الجانب الأيسر من المايكروmanipulator. الآن، الاستغناء عن ثمانية ميكروليتر من M2 المتوسطة في وسط الشريحة الاكتئاب. وتغطي مع النفط parafin الخفيفة لتجنب التبخر.
ثم، ضع 20 بيضة في المواقع الضحلة في الهبوط دون خلق فقاعات. بعد ذلك، تأكد من أن غيض من ماصة الحقن مفتوح. إذا لم يكن كذلك، اضغط على ماصة الحقن مع ماصة عقد لفتحه.
ثم، تعيين الحقن المجهري لحقن 20 ثانية. الآن، وذلك باستخدام ماصة عقد والضغط اليدوي التعرق بويضة المخصبة التي تحتوي على اثنين من pronuclei واثنين من الهيئات القطبية. ثم، باستخدام ماصة حقن حقن الفضاء ما بين البيض.
لا تلمس غشاء البلازما. ضبط الضغط بحيث يتم تعبئة الفضاء perivitelline مع الحل. يجب أن لا يتجاوز الضغط 600 باسكال هيكتو.
مباشرة بعد حقن البيض 20، نقل دفعة في حمام من M16 المتوسطة مسخن مسبقا. واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل زرعها. بعد 16 ساعة من تزاوج الإناث العاديات على الذكور مع قطع القناة الدافقة، تحقق من سدادات الجماع.
استخدم هذه الإناث للزرع. المقبل، وجعل ماصة زرع مع القطر الداخلي من حوالي 150 ميكرون. ومع النصائح المصقولة اللهب التي هي حوالي أربعة إلى خمسة ملليمترات طويلة.
تحميل ماصة مع الجنين اختبارها، والنفط البارافين الخفيفة إلى أعلى فقط نقطة الكتف. ثم، الطامح فقاعة الهواء الصغيرة وتحميل مزيد من الماصات مع M2 المتوسطة. بعد ذلك، تعرق فقاعة هواء ثانية.
الآن، وضع الأجنة في ماصة واحدة وراء الأخرى، والتقليل من حجم المتوسطة بين الأجنة. الانتهاء، عن طريق التعرق قطرة صغيرة جدا من النفط parafin واحد فقط على نطاق واسع. إعداد ماصة إعادة الزرع هو المفتاح ويحتاج إلى الكثير من الممارسة.
يجب أن يكون البيض في الماصات محاذاة مع عمليا أي وسيلة بينهما. بعد ذلك ، بعد تخدير الماوس وتأكيد التخدير مع قرصة إصبع قدم حلاقة قبالة اثنين ، اثنين من شرائح سنتيمتر من الشعر على طول الحبل الشوكي على مستوى الضلع الأخير. الآن، ضع الماوس على وسادة التدفئة على حقل معقمة والستائر، وترك نافذة على الجلد المكشوف.
المقبل, تطهير الجلد المكشوفة مع الدعك بالتناوب من يودوبروفيدون و 70 في المئة الإيثانول. للزرع، أولاً إجراء شق عرضي سنتيمتر واحد، ثم حرك الجلد بشكلٍ ثُمى حتى يظهر المبيض البرتقالي الملون عبر جدار الجسم. المقبل، وجعل شق خمسة ملليمتر مع مقص غرامة والتقاط وسادة الدهون مع المشبك البلدغ اتاوماتيك.
بمجرد أن يتم الإمساك بالوسادة ، اسحب المبيض ، وoviduct وأعلى الرحم. بعد ذلك، حدد موقع أمبولا وجعل hemisection مع مقص vannas، على الجزء oviduct التي تربط المبيض إلى أمبولا. ثم أدخل ماصات الجنين ونقل وإخراج البيض.
وقف في فقاعة الهواء الأولى بعد أن تم الافراج عن البيض. وقد المواد المطلوبة على استعداد لتكرار الإجراء على oviduct الثاني. وبمجرد الانتهاء، أغلق الجلد مع مقاطع الجرح.
مباشرة بعد إغلاق الجلد، داخل قنينة داخل الجسم ووضع الحيوان في غرفة الانتعاش مع عنصر التدفئة 39 درجة مئوية. مراقبة حتى أنها مستيقظا تماما. تم إنشاء المعدل وراثيا باستخدام الطريقة المعروضة.
تم إنتاج متجهات العدسة عالية باستخدام محسن قاعدة 2.3 كيلو لـ Neurogenin-3 لدفع eGFP. أو كتحكم، جزء من الكروموسوم ستة لدفع eGFP. وكان الاندماج في الأجنة ناجحا إلى حد ما.
من الأجنة، تم تقسيم برعم البنكرياس والمناعة للبحث عن التعبير الموضعي لـ eGFP. أكثر من 90 في المئة من ناقلات, مع محسن Neurogenin-3, أعرب eGFP في Neurog3 أعرب عن الخلايا. ومع ذلك، لم يعبر أي من ناقلات المكافحة المتكاملة عن eGFP في برعم البنكرياس.
تم تقييم مواقع التكامل عبر جيني بواسطة PCR الكمية، باستخدام جين CDX2 كتحكم. وكان متوسط عدد مواقع التكامل حوالي 20 باستخدام بناء Neurogenin-3، أو 10 باستخدام بناء التحكم. الغريب، titer transduction الفيروسية المستخدمة لبناء Neurogenin-3، كان حوالي ضعف ناقلات مكافحة.
اقتراح علاقة بين تتر النقل وعدد عمليات التكامل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد أعداد كبيرة من الأجنة المتحولة وراثيا المؤسس باستخدام حقن مارفيتيلين من ناقلات العدسة مع فعالية عالية. بمجرد اتقانها ، يمكن لهذه التقنية إنتاج ما يصل إلى 50 حيوانًا مؤسسًا في غضون يوم واحد من الحقن المجهري ، إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل حقن الحمض النووي الاتر النوى، من أجل إنشاء خطوط الماوس المعدلة وراثيا. لا تنس أن العمل مع ناقلات الزفيرة يخضع لإذن من لجنة الكائنات المعدلة وراثيا المحلية الخاصة بك. ويمكن أن تكون هذه النواقل خطرة للغاية وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
