Это альтернативный и простой в использовании метод для доставки генов, представляющих интерес для оплодотворенных яйцеклеток мыши с помощью лазерной перфорации zona pellucida и лентивирусной доставки генов. Лазерная перфорация процедуры донора мыши может также применяться к оплодотворенным яйцеклеткам других видов для облегчения проникновения других типов вирусов или трансфекционных реагентов. Основным преимуществом этой техники является то, что она не требует специальных навыков для микроманипуляции и микро-инъекций оплодотворенных яйцеклеток мыши.
Демонстрация оплодотворенной процедуры изоляции яйцеклетки мыши будет Пейдж Майерс, научный сотрудник из отделения сравнительной медицины в NIEHS. От 16 до 24 часов после спаривания, изолировать яичники и овадуки от самок мышей с вагинальными пробками, в соответствии со стандартными протоколами. Когда все ткани были собраны, разорвать ампулы каждого яичника друг от друга, и освободить оплодотворенные яйца, окруженные кучевыми клетками, и передать яйца в кучевых клетках 35 миллиметров блюдо, содержащее один х гиалуронидазы в свежем M2 среды, в течение трех-пяти минут инкубации при комнатной температуре.
Pipette яйца несколько раз, чтобы освободить кучевые клетки, и передать яйца в новый 35-миллиметровый блюдо, содержащее M2 среды, с пипеткой, чтобы смыть фермент. Затем перенесите вымытые яйца в 35-миллиметровое блюдо, содержащее калийный сикс, оптимизированный средний, или KSOM, и пипетку, чтобы смыть оставшуюся среду M2 и гиалуронидазы. Затем перенесите яйца на 35-миллиметровые ткани-культуры обработанные пластины, посеянные с 50 микролитров KSOM и два миллилитров диметилполисилоксана в течение двух часов эквилибрации при 37 градусах Цельсия, 5%углекислого газа и кислорода, и 90%азот.
В то время как яйца находятся в инкубаторе, настроить и откалибровать лазер XYClone, в соответствии с рекомендациями производителя. Когда яйца будут готовы, поместите первую пластину капли на стадии лазерного микроскопа, и вручную сосредоточить zona pellucida. После подтверждения того, что лазерный светодиодный свет виден через цель, переместить микроскоп этапе целевой zona со светодиодным лазером, и использовать компьютерное программное обеспечение, чтобы установить лазер XYClone до 250 микросекунд.
Отрегулируйте размер светодиодного света до соответствующих размеров, и перфорировать zona pellucida каждого яйца три раза с лазером, чтобы произвести три 10-микрометровых отверстий. Очень важно выполнить перфорацию быстро, но осторожно, так как оплодотворенные яйцеклетки не могут храниться за пределами инкубатора дольше 15 минут. Затем верните перфорированные яйца в инкубатор еще на два часа.
В конце второй инкубации, лечить 50 микролитер KSOM падение с двумя микролитров концентрированного лентивируса без смешивания. И вернуть яйца в инкубатор на четыре дня. Когда яйцеклетки превратились в бластоцисты, используйте нехирургическое устройство для переноса эмбрионов, чтобы внести около 10-15 эмбрионов в около двух микролитров KSOM.
Через 17 дней после переноса эмбриона, позвольте беременной мыши рожать естественным путем или собирать новорожденных путем кесарева сечения по мере необходимости. Затем, собирать ткани из щенков для генотипирования, чтобы определить скорость трансгенеза. Изолированное и трансудерированные мыши оплодотворенные яйцеклетки развития могут быть проверены под микроскопом ежедневно.
От 60 до 70% здоровых, необработанных эмбрионов развиваются в бластоцисты в течение трех-четырех дней. В то время как около 47% лазерных перфорированных, транс индуцированных эмбрионов развиваются в бластоцисты, 85% из которых выражают трансвеститный ген, представляющий интерес. Нацеливание лазера на истончение зоны, вместо того, чтобы создавать отверстие, позволяет развивающимся эмбрионам извлечь выгоду из нетронутой, инкапсулируя zona pellucida, оставаясь при этом вседозволенной для лентивирусной трансдукции.
Трансдукция с рекомбинантным лентивирусом, выражающих копепод GFP от удлиненного фактора 1A промоутера вызывает многочисленные лентивирусные интеграции, а также высокое выражение GFP под синей светодиодной лампой. При попытке этой процедуры, важно помнить, что, в то время как способность лентивирусов интегрироваться в геном хозяина делает их мощным инструментом для стабильной доставки генов, но случайная интеграция может также ввести вставки мутаций. Этот метод мог бы позволить исследователям в области генетики быстро разрабатывать трансгенные модели животных для изучения болезни для производства белка in vivo, или для функциональных исследований генов.
После этой процедуры, другие методы, такие как иммуногистохимия могут быть выполнены на изолированных образцах тканей от транс индуцированных щенков, чтобы ответить на дополнительные вопросы о местоположении и степени экспрессии генов в различных тканях, представляющих интерес. Не забывайте, что работа с лентивирусами может быть чрезвычайно опасной. Поэтому, пожалуйста, следуйте вашим институциональным руководящим принципам для работы с лентивирусами.
Носите личную защитную одежду и обеззараживать все отходы до удаления.
