Este método permite un cribado in vivo rápido en ratones, del efecto de un transgén, y está específicamente adaptado para realizar estudios de ganancia o pérdida de funciones, así como una respuesta y mapeo de motivos de ADN. La principal ventaja de esta técnica, es que el uso de la predicción de animales transgénicos están por encima del 70% de los recién nacidos y se pueden aplicar a cualquier cepa de ratón, incluidos los animales transgénicos. Después de eutanasiar a los ratones, recoge los oviductos.
Para comenzar la cirugía, use tijeras para hacer una incisión horizontal grande en la cavidad abdominal. Luego, localice el oviducto entre el útero y el ovario. A continuación, utilice fórceps curvos para eliminar el mesometrio y la membrana con los vasos sanguíneos prominentes.
Luego, separa el oviducto del ovario y disecciona el oviducto del ovario. Luego, tira del oviducto y corta del útero. Transfiera todos los oviductos recogidos a M2 medio a temperatura ambiente.
Al manipular los oviductos, tenga cuidado de evitar tocar la ampolla hinchada cargada con huevos fertilizados. A continuación, agregue una gota de 100 microlitros de solución de trabajo de hialuronidasa a un plato de 10 centímetros. Luego transfiera los dos oviductos en él, para eliminar las células cúmulos de los huevos.
Bajo un estereomicroscopio, utilice un par de jeringas de insulina para asegurar el oviducto mientras rompe la ampolla y dispersa los óvulos fertilizados. A continuación, utilice una pipeta de vidrio preparada con tubo y una boquilla para aspirar todos los huevos. Con esta herramienta, transfiéralas entre seis gotas de medio M2 para lavar las células cúmulos circundantes.
A continuación, transfiera los huevos lavados a un pozo de 10 milímetros, en una placa de cuatro pozos, lleno de precalentado con M16. Luego, transfiera el plato a una incubadora humidificada de 37 grados Celsius. En preparación, centrifugar la suspensión vectorial lentiviral preparada a 160 g durante dos minutos, para peletizar los residuos a menudo presentes en el stock lentiviral.
En un armario de seguridad de clase dos, transfiera los sobrenadantes a un nuevo tubo de 0,5 mililitros. A continuación, cargue un microlitro de sobrenadante en una pipeta de inyección. A continuación, coloque la pipeta de inyección en el micromanipulater del lado derecho.
Y fije la pipeta de sujeción al micromanipulador del lado izquierdo. Ahora, dispensar ocho microlitros de M2 medio en el centro del tobogán de depresión. Y cubra con aceite de parafina ligero para evitar la evaporación.
Luego, coloca 20 huevos en lugares poco profundos en la gota sin crear burbujas. A continuación, asegúrese de que la punta de la pipeta de inyección esté abierta. Si no es así, toque la pipeta de inyección con la pipeta de sujeción para abrirla.
A continuación, ajuste el microinyector para inyecciones de 20 segundos. Ahora, usando la pipeta de retención y la presión manual aspirar un óvulo fertilizado que contiene dos pronúcleos y dos cuerpos polares. A continuación, utilizando la pipeta de inyección, inyecte el espacio de perivitellina del óvulo.
No toque la membrana plasmática. Ajuste la presión para que el espacio de la perivitellina esté lleno de solución. La presión no debe exceder los 600 hecto pascales.
Inmediatamente después de inyectar los 20 huevos, transfiera el lote a un baño de medio M16 precalentado. Y incubarlos durante al menos 30 minutos antes de implantarlos. 16 horas después de aparear hembras normales a machos con vasectomías, compruebe si hay tapones de cópula.
Utilice estas hembras para la implantación. A continuación, hacer pipetas de implantación con diámetro interno de unos 150 micras. Y con puntas pulidas por llama de entre cuatro y cinco milímetros de largo.
Cargue una pipeta con aceite de parafina ligero probado en embrión justo por encima del punto del hombro. A continuación, aspirar una pequeña burbuja de aire y cargar aún más la pipeta con el medio M2. A continuación, aspirar una segunda burbuja de aire.
Ahora, dibuje los embriones en la pipeta uno detrás del otro, minimizando el volumen de medio entre los embriones. Terminar, aspirando una gota muy pequeña de aceite de parafina de un solo embrión ancho. La preparación de la pipeta de reimplantación es clave y necesita mucha práctica.
Los huevos de la pipeta deben estar alineados prácticamente sin un medio entre ellos. A continuación, después de anestesiar el ratón y confirmar la anestesia con un pellizco de los pies Afeitar dos tiras de pelo de dos centímetros a lo largo de la médula espinal a nivel de la última costilla. Ahora, coloque el ratón en una almohadilla de calefacción en un campo estéril y colóquelo, dejando una ventana a la piel expuesta.
A continuación, desinfecte la piel expuesta con exfoliantes alternos de yodoprovirona y 70 por ciento de etanol. Para la implantación, primero haga una incisión transversal de un centímetro, y luego deslice la piel lateralmente hasta que el ovario de color naranja sea visible a través de la pared del cuerpo. A continuación, haga una incisión de cinco milímetros con las tijeras finas y recoja la almohadilla de grasa con una abrazadera de bulldog atraumático.
Una vez que la almohadilla está agarrada, tire del ovario, el oviducto y la parte superior del útero. A continuación, localice la ampolla y haga una hemisectación con tijera vannas, en el segmento de oviducto que une el ovario con la ampolla. A continuación, introduzca la pipeta de embriones de transferencia y expulse los óvulos.
Detenerse en la primera burbuja de aire después de que los huevos han sido liberados. Tenga los materiales necesarios preparados para repetir el procedimiento en el segundo oviducto. Y una vez completada, cierra la piel con los clips de la herida.
Inmediatamente después de cerrar la piel, inyecte intraperitoneamente analgésico y coloque el animal en la cámara de recuperación con un elemento calefactor de 39 grados Celsius. Monitor hasta que esté completamente despierto. El animal transgénico se generó utilizando el método presentado.
Se produjeron vectores lentivirales de alto título utilizando un potenciador de base de 2,3 kilos para Neurogenin-3 para impulsar eGFP. O como control, un fragmento del cromosoma seis para conducir eGFP. La integración en embriones fue bastante exitosa.
A partir de los embriones, el brote pancreático se seccionó e inmunosuculó para buscar la expresión localizada de eGFP. Más del 90 por ciento de los vectores, con el potenciador Neurogenin-3, expresaron eGFP en neurog3 expresando células. Sin embargo, ninguno de los vectores de control integrados expresó eGFP en el brote pancreático.
Los sitios de integración de Transgene fueron evaluados por PCR cuantitativo, utilizando el gen CDX2 como control. El número medio de sitios de integración fue de aproximadamente 20 utilizando la construcción Neurogenin-3, o 10 utilizando la construcción de control. Curiosamente, el título de transducción viral utilizado para la construcción Neurogenin-3, era aproximadamente el doble del vector de control.
Sugerir una relación entre el título de transducción y el número de integraciones. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo generar un gran número de embriones transgénicos fundadores utilizando la inyección de perivitellina de vectores lentivirales con alta eficacia. Una vez dominada, esta técnica puede producir hasta 50 animales fundadores en un solo día de microinyección, si se realiza correctamente.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inyección de ADN pronuclear del título, con el fin de establecer líneas transgénicas de ratón. No olvide que trabajar con vectores lentivirales está sujeto a la autorización de su comité local de OMG. Estos vectores pueden ser extremadamente peligrosos y siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.
