Este método permite uma rápida triagem in vivo em camundongos, do efeito de um transgene, e é especificamente adaptado para realizar estudos de ganho ou perda de função, bem como um mapeamento de resposta e motivo de DNA. A principal vantagem dessa técnica é que o uso de previsão de animais transgênicos está acima de 70% do recém-nascido e pode ser aplicado a qualquer cepa de camundongos, incluindo animais transgênicos. Depois de eutanásia dos ratos, colete os ovidutos.
Para começar a cirurgia, use uma tesoura para fazer uma grande incisão horizontal na cavidade abdominal. Em seguida, localize o oviduto entre o útero e o ovário. Em seguida, use fórceps curvos para remover o mesomário e a membrana com os vasos sanguíneos proeminentes.
Em seguida, separe o oviduto do ovário e disseca o oviduto do ovário. Em seguida, puxe o oviduto e corte para longe do útero. Transfira todos os ovidutos coletados para m2 médios em temperatura ambiente.
Ao manusear os ovidutos, tenha cuidado para evitar tocar na ampola inchada carregada com ovos fertilizados. Em seguida, adicione uma gota de 100 microliteres de solução de trabalho de hialuronidase a um prato de 10 centímetros. Em seguida, transfira os dois ovidutos para ele, para remover as células cumulus dos ovos.
Sob um estereómico, use um par de seringas de insulina para proteger o oviduto enquanto rasga a ampola e dispersa os ovos fertilizados. Em seguida, use uma pipeta de vidro preparada com tubos e um porta-voz para aspirar todos os ovos. Usando esta ferramenta, transfira-as entre seis gotas de m2 médio para lavar as células cumulus circundantes.
Em seguida, transfira os ovos lavados para um poço de 10 milímetros, em uma placa de quatro poços, preenchido com pré-aquecido com M16. Em seguida, transfira o prato para uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius. Em preparação, centrífugue a suspensão do vetor lentiviral preparada a 160 g por dois minutos, para pelotar os detritos frequentemente presentes em estoque lentiviral.
Em um gabinete de segurança classe dois, transfira os supernantes para um novo tubo de 0,5 mililitro. Em seguida, carregue um microliter de supernadante, em uma pipeta de injeção. Em seguida, conecte a pipeta de injeção ao micromanipulador do lado direito.
E anexar a pipeta de retenção ao micromanipulador do lado esquerdo. Agora, dispense oito microliters de m2 médio no centro do slide de depressão. E cubra com óleo de parafina leve para evitar evaporação.
Em seguida, coloque 20 ovos nos locais rasos na gota sem criar bolhas. Em seguida, certifique-se de que a ponta da pipeta de injeção está aberta. Se não, toque a pipeta de injeção com a pipeta de retenção para abri-la.
Em seguida, defina o microinjetor para injeções de 20 segundos. Agora, usando a pipeta de retenção e pressão manual aspirar um óvulo fertilizado que contém dois pronuclei e dois corpos polares. Em seguida, usando a pipeta de injeção injete o espaço perivitelline do ovo.
Não toque na membrana plasmática. Ajuste a pressão para que o espaço perivitelline seja preenchido com solução. A pressão não deve exceder 600 hecto pascals.
Imediatamente após injetar os 20 ovos, transfira o lote para um banho de meio M16 pré-aquecido. E incuba-los por pelo menos 30 minutos antes de implantá-los. 16 horas após o acasalamento de fêmeas normais para machos com vasectomias, verifique se há plugues de cópula.
Use essas fêmeas para a implantação. Em seguida, faça pipetas de implantação com diâmetro interno de cerca de 150 mícrons. E com pontas polidas de chama que têm cerca de quatro a cinco milímetros de comprimento.
Carregue uma pipeta com embrião testado, óleo de parafina leve até um pouco acima do ponto do ombro. Em seguida, aspire uma pequena bolha de ar e carregue ainda mais a pipeta com meio M2. Em seguida, aspire uma segunda bolha de ar.
Agora, desenhe os embriões na pipeta um atrás do outro, minimizando o volume de meio entre os embriões. Finalize, aspirando uma pequena gota de óleo parafina apenas um embrião de largura. A preparação da pipeta de reimplantação é fundamental e precisa de muita prática.
Os ovos na pipeta devem estar alinhados com praticamente nenhum meio entre eles. Em seguida, depois de anestesiar o rato e confirmar a anestesia com uma pitada de dedo raspar duas tiras de cabelo de dois centímetros ao longo da medula espinhal ao nível da última costela. Agora, coloque o rato em uma almofada de aquecimento em um campo estéril e drape-o, deixando uma janela para a pele exposta.
Em seguida, higienize a pele exposta com esfoliantes alternados de iodoprovidone e 70% de etanol. Para a implantação, primeiro faça uma incisão transversal de um centímetro e deslize a pele lateralmente até que o ovário cor de laranja seja visível através da parede do corpo. Em seguida, faça uma incisão de cinco milímetros com a tesoura fina e pegue a almofada de gordura com um grampo buldogue atraumatic.
Uma vez que a almofada é agarrada, puxe o ovário, o oviduto e o topo do útero. Em seguida, localize a ampola e faça uma hemiseção com tesoura vannas, no segmento de oviduto que liga o ovário à ampola. Em seguida, introduza a pipeta de embrião de transferência e ejete os ovos.
Parando na primeira bolha de ar depois que os ovos foram liberados. Tenha os materiais necessários preparados para repetir o procedimento no segundo oviduto. E uma vez completado, feche a pele com clipes de ferida.
Imediatamente após o fechamento da pele, injete inexperitoneaticamente analgésico e coloque o animal na câmara de recuperação com um elemento de aquecimento de 39 graus Celsius. Monitore até que esteja totalmente acordado. O animal transgênico foi gerado utilizando-se o método apresentado.
Um vetor lentiviral de alto título foi produzido usando um melhorador de base de 2,3 quilos para neurogenina-3 para conduzir eGFP. Ou como controle, um fragmento de cromossomo seis para dirigir eGFP. A integração em embriões foi bastante bem sucedida.
Dos embriões, o broto pancreático foi seccionado e imunosterado para procurar expressão localizada de eGFP. Mais de 90% dos vetores, com o intensificador neurogenin-3, expresso eGFP em células expressas neurog3. No entanto, nenhum dos vetores de controle integrados expressou eGFP no broto pancreático.
Os locais de integração transgene foram avaliados por PCR quantitativo, utilizando o gene CDX2 como controle. O número médio de locais de integração foi de cerca de 20 utilizando a construção neurogenina-3, ou 10 usando a construção de controle. Curiosamente, o titer de transdução viral usado para a construção neurogenina-3, era cerca de o dobro do vetor de controle.
Sugerindo uma relação entre o titer de transdução e o número de integrações. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar um grande número de embriões transgênicos fundadores usando injeção de perivitelline de vetores lentivirais com alta eficácia. Uma vez dominada, essa técnica pode produzir até 50 animais fundadores em um único dia de microinjeção, se for realizada corretamente.
Após este procedimento, outros métodos como a injeção de DNA pronuclear titer podem ser realizados, a fim de estabelecer linhas de camundongos transgênicos. Não se esqueça que trabalhar com vetores lentivirais está sujeito à autorização do seu comitê local de OGM. Esses vetores podem ser extremamente perigosos e a precaução deve ser sempre tomada durante a realização deste procedimento.
