Bu yöntem farelerde hızlı in vivo tarama sağlar, bir transgen etkisi, ve özellikle kazanç veya fonksiyon çalışmaları kaybı gerçekleştirmek için uyarlanmıştır, yanı sıra bir cevap ve DNA güdü haritalama. Bu tekniğin en büyük avantajı, transgenik hayvanların tahmini kullanımının yenidoğanın %70'inin üzerinde olması ve transgenik hayvanlar da dahil olmak üzere her türlü fare suşlarına uygulanabiliyor olmasıdır. Fareler ötenazi sonra, oviducts toplamak.
Ameliyata başlamak için, karın boşluğuna büyük bir yatay kesi yapmak için makas kullanın. Sonra, rahim ve yumurtalık arasında oviduct bulmak. Daha sonra, belirgin kan damarları ile mesometrium ve membran kaldırmak için kavisli forceps kullanın.
Daha sonra oviduct'ı yumurtalıktan ayırın ve yumurtalıkları yumurtalıktan ayırın. Sonra, oviduct üzerinde römorkör ve rahim kesip. Toplanan tüm oviduct'ları oda sıcaklığında M2 ortamına aktarın.
Oviducts kullanırken, döllenmiş yumurta yüklü şişmiş ampulla dokunmaktan kaçınmak için dikkatli olun. Daha sonra, 10 santimetrelik bir tabağa 100 mikrolitrelik bir damla hyaluronidase çalışma çözeltisi ekleyin. Daha sonra yumurtaküm hücrelerini çıkarmak için içine iki oviducts aktarın.
Stereomikroskop altında, ampulla yırtılma ve döllenmiş yumurta dağıtma sırasında oviduct güvenli bir çift insülin şırınga kullanın. Sonra, tüm yumurta aspire etmek için tüp ve ağızlık ile hazırlanmış bir cam pipet kullanın. Bu aracı kullanarak, çevredeki kümülüs hücrelerini yıkamak için m2 orta altı damla arasında aktarın.
Daha sonra, yıkanmış yumurtaları 10 milimetrelik bir kuyuya, önceden M16 ile ısıtılmış dört kuyu tabağına aktarın. Daha sonra, bir nemlendirilmiş 37 derece santigrat inkübatör için çanak aktarın. Hazırlık olarak, iki dakika için 160 g hazırlanan lentiviral vektör süspansiyon santrifüj, genellikle lentiviral stok mevcut enkaz pelet.
İkinci sınıf bir güvenlik kabininde, süpernatantları yeni bir 0,5 mililitrelik tüpe aktarın. Sonra, bir enjeksiyon pipet içine supernatant bir mikrolitre yükleyin. Daha sonra enjeksiyon pipetini sağ taraftaki mikromanipülatöre takın.
Ve tutucu pipeti sol taraftaki mikromanipülatöre takın. Şimdi, depresyon slayt merkezinde M2 orta sekiz mikrolitre dağıtmak. Ve buharlaşmayı önlemek için hafif parafin yağı ile kaplayın.
Sonra, kabarcıklar oluşturmadan damla sığ yerlere 20 yumurta yerleştirin. Daha sonra, enjeksiyon pipetucu ucu açık olduğundan emin olun. Değilse, açmak için tutma pipet ile enjeksiyon pipet dokunun.
Sonra, 20 saniyelik enjeksiyonlar için mikroenjektör ayarlayın. Şimdi, tutma pipetve manuel basınç kullanarak iki pronüklei ve iki kutup cismi içeren döllenmiş bir yumurtaaspire. Sonra, enjeksiyon pipet kullanarak yumurta perivitelline alan enjekte.
Plazma zarına dokunmayın. Basıncı, perivitelline alanının çözeltiyle dolması için ayarlayın. Basınç 600 hecto pascal'ı geçmemelidir.
Hemen 20 yumurta enjekte ettikten sonra, önceden ısıtılmış M16 orta bir banyo içine toplu aktarın. Ve yerleştirmeden önce en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Normal dişileri vazektomili erkeklere çiftleştirdikten 16 saat sonra çiftleşme fişleri kontrol edin.
Bu dişileri implantasyon için kullan. Daha sonra, yaklaşık 150 mikron iç çapı ile implantasyon pipetler olun. Ve yaklaşık 4-5 milimetre uzunluğunda alev cilalı ipuçları ile.
Embriyo test ile bir pipet yükleyin, omuz noktasının hemen üzerinde hafif parafin yağı. Daha sonra, küçük bir hava kabarcığı aspire ve daha fazla M2 orta ile pipet yükleyin. Sonra, ikinci bir hava kabarcığı aspire.
Şimdi, embriyoları birbirinin arkasındaki pipete yerleştirin, embriyolar arasındaki ortamın hacmini en aza indirin. Bitirmek, parafin yağı çok küçük bir damla sadece bir embriyo genişliğinde aspire ederek. Reimplantasyon pipetinin hazırlanması çok önemlidir ve çok fazla pratik yapılması gerekir.
Pipetteki yumurtalar aralarında neredeyse hiç orta olmayan bir şekilde hizalanmalıdır. Sonra, fare anestezi ve son kaburga düzeyinde omurilik boyunca saç iki santimetre şeritler kapalı iki, iki santimetre saç shave kapalı bir parmak çimdik tıraş ile anestezi doğruladıktan sonra. Şimdi, fareyi steril bir alana bir ısıtma yastığına yerleştirin ve açıkta kalan cilde bir pencere bırakarak onu örtün.
Daha sonra, iodoprovidone ve yüzde 70 etanol alternatif scrubs ile maruz kalan cilt dezenfekte. İmplantasyon için, önce bir santimetre lik enine kesi yapın ve sonra turuncu renkli yumurtalık vücut duvarından görünene kadar cildi yanal olarak kaydırın. Sonra, ince makas ile beş milimetrelik bir kesi yapmak ve atravmatik bulldog kelepçe ile yağ yastığı almak.
Bir kez yastık kavradı, yumurtalık çekin, oviduct ve rahim üst. Daha sonra, ampulla bulmak ve vannas makas ile bir hemisection yapmak, ampulla yumurtalık bağlayan oviduct segmentinde. Sonra, transfer embriyo pipet tanıtmak ve yumurta fırlatmak.
Yumurtalar serbest bırakıldıktan sonra ilk hava kabarcığında durmak. İkinci oviduct üzerinde prosedürü tekrarlamak için gerekli malzemeleri hazırlayın. Ve tamamlandığında, yara klipleri ile deri kapatın.
Deriyi kapattıktan hemen sonra, intraperitonealy analjezik enjekte ve 39 derece Santigrat ısıtma elemanı ile kurtarma odasına hayvan yerleştirin. Tamamen uyanana kadar izleyin. Transgenik hayvan sunulan yöntem kullanılarak üretildi.
Yüksek bir titer lentiviral vektörler eGFP sürücü Neurogenin-3 için 2.3 kilo baz arttırıcı kullanılarak üretildi. Ya da kontrol olarak, eGFP'yi sürmek için kromozom altının bir parçası. Embriyolara entegrasyon oldukça başarılı oldu.
Embriyolardan, pankreas tomurcuk kesitli ve immünostained eGFP lokalize ifade aramak için. Vektörlerin yüzde 90'ından fazla, Neurogenin-3 arttırıcı ile, Neurog3 ifade hücreleri eGFP ifade. Ancak, entegre kontrol vektörleri hiçbiri pankreas tomurcuk eGFP ifade.
Transgen entegrasyon bölgeleri, CDX2 geni kontrol olarak kullanılarak kantitatif PCR tarafından değerlendirildi. Entegrasyon sitelerinin ortalama sayısı yaklaşık 20 Neurogenin-3 yapı, ya da 10 kontrol yapısı kullanılarak. İlginçtir, Nörogenin-3 yapısı için kullanılan viral transdüksiyon titre, kontrol vektörünün yaklaşık iki katıydı.
Transdüksiyon titreci ile tümleştirme sayısı arasında bir ilişki olduğunu düşündürüyor. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek etkinliği ile lentiviral vektörlerin perivitellin enjeksiyonu kullanarak kurucu transgenik embriyoların çok sayıda oluşturmak için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bir kez hakim, bu teknik mikroenjeksiyon tek bir gün içinde 50 kurucu hayvanlar üretebilir, düzgün yapılırsa.
Bu işlemden sonra transgenik fare hatları oluşturmak için titer pronükleer DNA enjeksiyonu gibi başka yöntemler de yapılabilir. Lentiviral vektörlerle çalışmanın yerel GDO komitenizden gelen yetkiye tabi olduğunu unutmayın. Bu vektörler son derece tehlikeli olabilir ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman önlem alınmalıdır.
